本文關(guān)鍵詞：TLR3、TLR7受體在呼吸道合胞病毒感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549)后,Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)3、7的水平變化,初步研究TLR3和TLR7活化后在RSV感染中介導(dǎo)產(chǎn)生的I型干擾素(interferon,IFN)抗病毒作用及其可能的調(diào)控機(jī)制,為臨床預(yù)防與治療RSV的感染提供新的思路。方法:以RSV感染A549細(xì)胞后,分為正常對(duì)照組、RSV感染組、TLR3小干擾RNA(TLR3 si RNA)沉默組、TLR7小干擾RNA(TLR7 si RNA)沉默組。分別于感染的4h、8h、12h和24 h后收集各組細(xì)胞以及上清液,以未感染病毒的細(xì)胞組為正常對(duì)照組。(1)用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,半定量RT-PCR法檢測(cè)各組TLR3、TLR7、干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)、干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)、干擾素α(IFN-α)、干擾素β(IFN-β)的m RNA表達(dá)量變化;(2)免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)RSV感染A549細(xì)胞各組在4h、8h、12h和24 h的TLR3、TLR7蛋白水平的變化。(3)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)感染不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-1β含量的變化。(4)空斑形成實(shí)驗(yàn)(plaque forming unit,PFU)測(cè)定感染A549細(xì)胞的RSV病毒滴度以及各組病毒增殖情況。結(jié)果:①在m RNA轉(zhuǎn)錄水平,感染組上調(diào)TLR3/7、IRF3/7、IFN-α/β的m RNA基因表達(dá);在兩沉默組,TLR3/7、IRF3/7、IFN-α/β的m RNA較感染組相同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量明顯減少,減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;TLR3 si RNA沉默組,IFN-β下降較IFN-α更為顯著,而在TLR7 si RNA沉默組,IFN-α下降較IFN-β更為顯著。②在蛋白表達(dá)水平,RSV感染組上調(diào)TLR3、TLR7蛋白的表達(dá);在兩沉默組,TLR3和TLR7蛋白量比感染組相同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量減少;且在TLR3 si RNA沉默組,TLR3蛋白量下降較TLR7更明顯,TLR7 si RNA沉默組,TLR7的蛋白表達(dá)量較TLR3蛋白量下降更明顯;③RSV感染A549細(xì)胞后,明顯上調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α/β和炎性因子TNF-α、IL-1β的分泌量,兩沉默組IFN-α/β的量均下降,炎性因子的量升高,在TLR3 si RNA沉默組IFN-β較IFN-α下降的更明顯,炎性因子升高的更明顯;TLR7 si RNA沉默組IFN-α的量下降的更明顯。④RSV感染組,病毒增殖滴度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而上調(diào);兩沉默組的病毒增殖滴度都較感染組高,且TLR3 si RNA沉默組較TLR7 si RNA沉默組病毒增殖滴度更高。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)證明,RSV感染A549細(xì)胞后,TLR3及TLR7被活化能夠抵抗呼吸道合胞病毒感染,分別通過(guò)IRF3和IRF7途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生I型干擾素,發(fā)揮了抗病毒免疫;而抗病毒免疫反應(yīng)中TLR3途徑可能更占主導(dǎo)地位;且由TLR3誘導(dǎo)產(chǎn)生的最主要I型干擾素是IFN-β,由TLR7誘導(dǎo)產(chǎn)生的最主要I型干擾素是IFN-α。
【關(guān)鍵詞】：呼吸道合胞病毒 Toll樣受體 I型干擾素 TLR3/7 siRNA A549細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R373
【目錄】：

• 英文縮略詞6-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1. 前言12-14
• 2. 材料與方法14-28
• 2.1 材料14-15
• 2.1.1 病毒和細(xì)胞14
• 2.1.2 試劑購(gòu)置14
• 2.1.3 儀器和設(shè)備14-15
• 2.2 方法15-27
• 2.2.1 配制溶液15-17
• 2.2.2 RSV增殖及感染單位量測(cè)定17-18
• 2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒接種18
• 2.2.4 siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞與檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率18-19
• 2.2.5 實(shí)驗(yàn)分組19
• 2.2.6 TLR3,TLR7, IRF3, IRF7, IFN-α, IFN-β 在RSV感染組和siRNA沉默組的mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)19-22
• 2.2.6.1 A549細(xì)胞中總RNA提取20
• 2.2.6.2 RNA定性與定量分析20
• 2.2.6.3 兩步RT-PCR方法檢測(cè)20-22
• 2.2.6.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果22
• 2.2.7 A549細(xì)胞TLR3,TLR7蛋白的Western blot檢測(cè)22-26
• 2.2.7.1 總蛋白樣本的制備22
• 2.2.7.2 Lowry法蛋白定量22-24
• 2.2.7.3 蛋白免疫印跡法檢測(cè)TLR3,TLR7的蛋白表達(dá)24-26
• 2.2.8 E L I S A法 檢測(cè)A 54 9 細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-α,IFN-β,TNF-α,IL-1β 含量26-27
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析27-28
• 3. 結(jié)果28-45
• 3.1 病毒PFU檢測(cè)28
• 3.2 轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)和 siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后 mRNA 表達(dá)情況28-29
• 3.3 檢測(cè)RSV感染組和siRNA沉默組中TLR3、TLR7，IRF3，IRF7，，IFN-α，IFN-β的m RNA轉(zhuǎn)錄水平29-37
• 3.3.1 TLR3 mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)29-31
• 3.3.2 TLR7 mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)31-32
• 3.3.3 IRF3 mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)32-33
• 3.3.4 IRF7 mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)33-35
• 3.3.5 IFN-α mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)35-36
• 3.3.6 IFN-β mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)36-37
• 3.4 TLR3,TLR7蛋白在各組不同時(shí)間點(diǎn)蛋白的水平變化37-39
• 3.4.1 TLR3在各組不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白水平變化37-38
• 3.4.2 TLR7在各組不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白水平變化38-39
• 3.5 ELISA檢測(cè)A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-α,IFN-β,TNF-α,IL-1β 的變化39-43
• 3.6 空斑形成實(shí)驗(yàn)（PFU）檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清病毒滴度43-45
• 4. 討論45-48
• 5. 結(jié)論48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 附錄 個(gè)人簡(jiǎn)歷53-54
• 致謝54-55
• 綜述55-62
• 參考文獻(xiàn)60-62

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 張艷芳;馬春旺;金嬋;晉若冰;湯瑩;楊勇驥;;2種晶型納米二氧化鈦材料對(duì)A549細(xì)胞的毒性效應(yīng)[J];河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年02期

2 孫曉東;王s

本文編號(hào)：268822