【摘要】：表皮生長(zhǎng)因子(EGF)屬于促生長(zhǎng)因子家族成員之一,是表皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和間充質(zhì)等敏感細(xì)胞的絲裂原,為最有力的促細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞因子之一�，F(xiàn)已證明,人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)可刺激外胚層和內(nèi)胚層來(lái)源的一些組織有絲分裂和刺激合成作用,可加速皮膚、角膜上皮、胃腸道粘膜上皮的損傷修復(fù)。 目前EGF重組蛋白已試用于促外科手術(shù)傷口及創(chuàng)面愈合、促角膜創(chuàng)傷的愈合及促胃腸道潰瘍的研究,部分已進(jìn)入臨床應(yīng)用。但由于hEGF重組蛋白為小分子蛋白質(zhì),半衰期短,在體內(nèi)易降解,如采用合適的載體將hEGF基因?qū)塍w內(nèi)或?qū)⑥D(zhuǎn)染hEGF基因的靶細(xì)胞植入損傷局部,使其在損傷部位持續(xù)分泌表皮生長(zhǎng)因子,必將有利于創(chuàng)面的愈合。 本研究利用基因工程技術(shù)克隆了人表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)基因,并完成真核表達(dá)載體的構(gòu)建。在脂質(zhì)體的協(xié)助下將pcDNA3.1-hEGF導(dǎo)入角膜組織細(xì)胞中,表達(dá)hEGF重組蛋白,為hEGF基因治療組織損傷奠定了基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法 1.hEGF基因克隆提取富含hEGF組織中的總RNA,經(jīng)RT-PCR獲得hEGF基因,克隆到載體PGEM-TEasy中,使hEGF擴(kuò)增,篩選鑒定重組體。 2.hEGF基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及序列分析通過(guò)設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn),將hEGF基因定向克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1中,完成hEGF真核表達(dá)載體構(gòu)建。用生物學(xué)軟件對(duì)hEGF基因序列測(cè)定及分析。 3.hEGF基因轉(zhuǎn)染陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectin與pcDNA3.1-hEGF重組質(zhì)粒以適當(dāng)比例 鄭州大學(xué)2004屆碩士研究生畢業(yè)論文 人表皮生長(zhǎng)因子基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及基因轉(zhuǎn)染 混合,轉(zhuǎn)染角膜組織,分別從DNA、RNA、蛋白質(zhì)三個(gè)水平上檢測(cè)EGF基因表達(dá)情況。 結(jié)果 1.hEGF基因克隆RT一PCR擴(kuò)增可從胎兒領(lǐng)下腺、成人腮腺獲得hEGF基因片段,長(zhǎng)度 為162bp,胎兒領(lǐng)下腺中hEGF基因與克隆載體PGEM一TEasy連接,完成hEGF基因克隆, 經(jīng)藍(lán)白篩選、酶切及PCR鑒定重組體,獲得陽(yáng)性克隆。 2.hEGF基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及序列分析經(jīng)Hindlll、Ba栩I酶切PGEM一TEasy一hEGF, 將hEGF基因定向克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1中。序列分析結(jié)果表明,pcDNA3.1一hEGF 基因序列與Genbank hEGF序列相比,二者堿基同源性達(dá)98.2%,為相同的氨基酸編碼。 3.hEGF基因轉(zhuǎn)染PCR、RT一PCR在轉(zhuǎn)染后21天之內(nèi),在DNA、RNA水平上可檢測(cè)到hEGF 基因;免疫組織化學(xué)檢測(cè)法最早在轉(zhuǎn)染后24h可檢測(cè)到hEGF基因表達(dá),在轉(zhuǎn)染后2周 之內(nèi)均可以檢測(cè)到hEGF表達(dá),而2周之后,表達(dá)結(jié)果為陰性。 結(jié)論 1.不同組織中hEGF含量不同,胎兒領(lǐng)下腺較高,與hEGF促胚胎發(fā)育作用有關(guān); 2.完成了hEGF克隆載體的構(gòu)建; 3.完成了hEGF基因真核表達(dá)載體構(gòu)建; 4.hEGF基因序列與Genbank上公布的序列相比,堿基同源性達(dá)98.2%,氨基酸完全相 同; 5.pCDNA3.1一hEGF重組質(zhì)粒與Lipofectin以適當(dāng)比例混合形成的微囊可攜帶hEGF基 因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)功能蛋白。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2680870