發(fā)布時間：2020-05-25 06:02

【摘要】： 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）持續(xù)性感染在我國是一個嚴(yán)重的健康 問題，探索有顯著療效的治療措施是目前的研究熱點。基因治療是抗HBV持續(xù)性 感染一個頗有希望的途徑。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對HBV生物學(xué)性狀尤其是復(fù) 制、包裝過程的了解逐步加深：HBV顆粒包裝始于核心顆粒（core particle）的形 成，二個核心蛋白形成一個二聚體，120個二聚體聚合成一個核心顆粒。核心顆粒 與前基因組RNA、DNA聚合酶結(jié)合，被覆表面蛋白后，包裝形成成熟的HBV顆 粒。在這一過程中，起關(guān)鍵作用的是C蛋白二聚體的形成。利用突變型HBV C蛋 白干擾野生型C蛋白形成二聚體的顯性負(fù)調(diào)節(jié)（dominant negative，DN）突變體， 已證明在體外有明顯抑制HBV顆粒包裝的作用，有望成為in vivo基因治療HBV 持續(xù)感染的理想方法。 基于對HBV分子生物學(xué)性狀和抗HBV感染胞內(nèi)免疫的相關(guān)研究成果，，本研究對 中國人adr_1亞型HBV體外DN突變體治療進(jìn)行了基礎(chǔ)研究。為此，我們通過PCR從 pHBV-A_1質(zhì)粒中擴增了全長的C基因及S基因，亞克隆至pGEM-T載體上后，選擇合 適方向的兩株質(zhì)粒進(jìn)行C基因與S基因融合。構(gòu)建出C蛋白C末端與S蛋白N末端 的融合基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1~+-CS。該表達(dá)載體經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)同時轉(zhuǎn)染兩株細(xì)胞 HepG2及HepG2215。轉(zhuǎn)染48-72h后加入G418篩選10天左右。挑選陽性克隆擴增 后，RT-PCR和免疫組化證實了突變核心蛋白的胞內(nèi)表達(dá)。直接抽提HepG2215細(xì)胞 漿內(nèi)HBV DNA，斑點雜交顯示表達(dá)了突變C蛋白（融合蛋白）的HepG2215細(xì)胞漿 內(nèi)HBV DNA量不同程度地低于陰性對照組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1~+空質(zhì)粒）。 10％ HBV陽性血清（PCR證實HBV DNA的存在）感染HepG2后72h，抽提細(xì)胞漿內(nèi) HBV DNA。斑點雜交顯示，與陰性對照組比較，表達(dá)了突變C蛋白的HepG2不同程 度地抑制了HBV的攻擊。 以上工作表明，本研究所構(gòu)建的pcDNA3.1~+-CS真核表達(dá)載體可以在HepG2及 HePG2215細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出突變型核心蛋白，進(jìn)一步研究表明該突變蛋白具有抗HBV 顆粒包裝的顯性負(fù)調(diào)節(jié)功能，能不同程度地提高轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞內(nèi)免疫能力。本研究 在成功構(gòu)建了中國人adr_1亞型HBV感染的突變型核心蛋白表達(dá)載體的同時，證實了 國外DN突變體抗病毒感染結(jié)論，為進(jìn)一步DN突變體抗HBV感染研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號】：R373.21

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本文編號：2679681