【摘要】：血管生成是指從已經(jīng)存在的血管周?chē)鲂碌难艿倪^(guò)程。腫瘤組織的血管生成對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是必須的,外源性抑制血管生成可以明顯的抑制腫瘤的生長(zhǎng),甚至可以使腫瘤消退。因此Folkman提出一個(gè)開(kāi)創(chuàng)性的假說(shuō):阻斷腫瘤血管生成就可以阻止腫瘤的生長(zhǎng)。血管生成是通過(guò)調(diào)節(jié)促血管生成因子和抗血管生成因子的平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 內(nèi)皮抑素(Endostatin)是一種內(nèi)源性的抗腫瘤血管生成物質(zhì),由O’Reilly等從小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞EOMA的培養(yǎng)液中分離得到的,氨基酸序列顯示該物質(zhì)為膠原ⅩⅧ C末端非膠原區(qū)內(nèi)的184個(gè)氨基酸片段。 內(nèi)皮抑素的特異性功能位點(diǎn)尚未研究清楚。有的研究者發(fā)現(xiàn)當(dāng)把C末端部分序列(9個(gè)氨基酸:NSFMTSFSK;17個(gè)氨基酸:SYIVLCIENSFMTSFSK)去除構(gòu)成EM1、EM2,并將內(nèi)皮抑素、EM1和EM2分別作用于腎細(xì)胞癌RCC移植瘤動(dòng)物模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EM1保留了內(nèi)皮抑素的生物學(xué)活性,而比EM1多刪了8個(gè)氨基酸的EM2卻無(wú)活性,說(shuō)明了C末端序列上的保守性可能與內(nèi)皮抑素的生物學(xué)活性有關(guān)。本研究在克隆基因設(shè)計(jì)引物時(shí), 選擇性的去除內(nèi)皮抑素C末端13個(gè)氨基酸(LCIENSFMTSFSK)相對(duì)應(yīng)的堿基序列,得到內(nèi)皮抑素的一個(gè)突變體,命名為EM13。用基因工程的方法構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEGFP-N2-EM13和pEGFP-N2-Endostatin,將兩者轉(zhuǎn)入肝癌腹水瘤H22細(xì)胞中并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),從而達(dá)到研究C末端去除是否影響內(nèi)皮抑素生物學(xué)作用的目的。為此作了以下工作: 1.從小鼠肝臟組織中提取總RNA,設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物,分別帶有Xho Ⅰ和Sac Ⅱ的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。RT-PCR法擴(kuò)增EM13基因片段,并引入上述兩個(gè)酶切位點(diǎn)。 2.將RT-PCR產(chǎn)物與pMD18-T 載體相連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中,篩選出陽(yáng)性克隆,并以雙脫氧末端終止法對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-T-EM13進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果表明與已知小鼠內(nèi)皮抑素基因序列一致。 3.用XhoⅠ和SacⅡ酶切此測(cè)序載體,將目的條帶回收純化,將其插入到質(zhì) WP=5 粒載體pEGFP-N2相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上,構(gòu)建表達(dá)載體pEGFP-N2-EM13,同時(shí)構(gòu)建表達(dá)載體pEGFP-N2-Endostatin。 4.脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入肝癌腹水瘤H22細(xì)胞中,并將篩選后的H22細(xì)胞接種于Balb/c純系小鼠皮下,觀察內(nèi)皮抑素和EM13對(duì)H22細(xì)胞體內(nèi)致瘤能力的影響。結(jié)果表明轉(zhuǎn)Endostatin組小鼠的瘤體重量與未轉(zhuǎn)染組的差異雖未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但明顯減輕。且腫瘤組織血管密度相對(duì)較低,說(shuō)明轉(zhuǎn)Endostatin基因可使H22細(xì)胞的致瘤能力下降。轉(zhuǎn)EM13組小鼠與未轉(zhuǎn)染組小鼠的瘤體重量和血管密度無(wú)明顯差別,說(shuō)明轉(zhuǎn)EM13基因?qū)22細(xì)胞的致瘤能力可能沒(méi)有影響。 本研究成功的克隆了小鼠內(nèi)皮抑素EM13基因,構(gòu)建了表達(dá)載體pEGFP-N2-EM13、pEGFP-N2-Endostatin,并將質(zhì)粒導(dǎo)入H22細(xì)胞中,進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。結(jié)果提示:內(nèi)皮抑素突變體 EM13可能由于C末端重要的氨基酸被去除而失去了部分抑瘤功能,C末端部分氨基酸可能對(duì)其活性的發(fā)揮起重要作用,但具體作用和機(jī)制需待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 黃倩,李川源;病毒與非病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的比較研究[J];中華病理學(xué)雜志;2000年02期

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本文編號(hào)：2679190