【摘要】： 前言 人類基因組中存在著廣泛的多態(tài)性，最簡單的多態(tài)形式是發(fā)生在基因組中的單個核苷酸的替代，即單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)。SNP是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90％以上。按照1％的頻率估計，在人類基因組中每100-300個核苷酸就有一個SNP，因此，整個人類基因組(3.2×10~9bp)中至少有1，100萬以上的SNP。單個堿基變異(通常人群分布小于1％)能導(dǎo)致基因功能異常者習(xí)慣上被稱為突變(Mutation)。SNP在人類遺傳學(xué)研究中有重要意義，作為遺傳標記，在復(fù)雜疾病的基因定位、關(guān)聯(lián)分析、個體疾病易感性分析與藥物基因組學(xué)的研究中發(fā)揮著重要的作用。首先，SNP可以發(fā)生在蛋白質(zhì)編碼區(qū)，如果是非同義SNP可導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成時氨基酸的“錯義”改變。SNP也可發(fā)生在基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)以外的區(qū)域，并通過改變相關(guān)基因的調(diào)控來影響基因的功能。這些基因組DNA序列的變異，被認為是決定人們的疾病易感性和藥物反應(yīng)的決定因素。其次，SNP還可作為遺傳作圖研究中的遺傳標記，幫助定位和鑒定功能基因。此外，單核苷酸多態(tài)性圖譜還可以鑒定基因組其他的遺傳標記，從而大大簡化了全基因組圖譜。 氨基肽酶N(Aminopeptidase N，APN)是人類冠狀病毒HCoV-229E的細胞受體，在SARS流行期間被認為可能是SARS冠狀病毒(SARS-CoV)S蛋白的受體。篩查和發(fā)現(xiàn)APN編碼基因ANPEP內(nèi)SNP，對人類冠狀病毒感染性疾病的遺傳易感性研究非常重要。因此，本文聯(lián)合應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)及DNA測序技術(shù)對ANPEP基 因進行了基因變異(突變和多態(tài))篩查。 材料與方法 1.標本和基因組DNA提取:采集正常無關(guān)個體抗凝外周血。采用常 規(guī)酚一氯仿抽提法提取基因組DNA。 2.ANPEP基因變異篩查:聯(lián)合應(yīng)用PCR一DHPLC技術(shù)對A刀PEP基因 進行變異篩查并測序確認。 2.1引物設(shè)計和PCR擴增:設(shè)計A刀PEP基因全部外顯子的引物，引物 序列位于各個外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子內(nèi)，每個擴增片段包含外顯子及其兩側(cè) 部分內(nèi)含子序列。 2 .2 DHpLC變異篩查:根據(jù)wAvE一Make產(chǎn)M4.l軟件分析的各個擴增片 段的解鏈溫度曲線，確定檢測溫度，進行樣本檢測。 2.3測序分析:對于色譜峰型改變的樣本，，將其PCR擴增產(chǎn)物純化回 收，DNA測序由TaKaRa寶生物(大連)工程有限公司完成。 3.生物信息學(xué)分析 利用ExpASy蛋白質(zhì)組服務(wù)器PROSITE數(shù)據(jù)庫(http:刀us.expasy.0喇 prosite/)進行APN蛋白基序分析。應(yīng)用EBI FASTA version3(h絲P二蘭匕竺竺竺二 ebi.ae.uk/fasta 33/)和NCBI BLAST(http://www.nebi.nlm.nih.goV/ BLAST/)進行APN蛋白同源性分析。 實驗結(jié)果 在A刀PEP基因內(nèi)共檢測到21種SNP位點，其中9種位于外顯子，12 種位于內(nèi)含子。外顯子內(nèi)的SNP中，6種為非同義SNP(編碼氨基酸改變的 SNP)，即:Q86R(257AG)，竹21M(962CT)，1603M(1809AG)，S65lL (1952CT)，s752N(2255GA)和G764R(2290GA);3種同義SNp，即: 幾27P(68 IGA)，竹95T(2385CT)和18711(2613AG)。位于內(nèi)含子的 12種SNP為:IVS7+17GA，IVS13+41AC，IVS14一16AG，IVS17+12C G，IVS17+44CT，IVS17一IGC，IVS19+37TA，IVS19+75AG， IVS19+126CT，IVS19+64AG，IVS19+137GT及IVS20+114CA.。 除了Q86R(257AG)，18711(2613AG)和 IvS17一IGC以外，其余18 種為新發(fā)現(xiàn)的SNP。 結(jié)論 1.聯(lián)合應(yīng)用PCR一DHPLC方法檢測到21種A刀PEP基因內(nèi)SNP，其中 16種為新發(fā)現(xiàn)的SNP。 2.APNPE基因內(nèi)SNP的發(fā)現(xiàn)，對HCOV一29E等人類冠狀病毒感染的 遺傳易感性研究有重要應(yīng)用價值。
【圖文】：

圖IA刀PEP外顯子1及兩側(cè)內(nèi)含子序列DHPLC峰型ehromatogramprofileforA刀PEPexonlandadjaeentintronieseqU

圖3A刃尸EP外顯子2及兩側(cè)內(nèi)含子序列DHPLC峰型e腸matogralnprofileforA刀pEpexonZandadjacentin加nicse
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：Q78

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本文編號：2679224