【摘要】： 雜草與農(nóng)作物競爭水分、養(yǎng)料和光照，影響農(nóng)作物的產(chǎn)量、品質(zhì)，還是許多病害的中間寄主或越冬場所，通過除草劑來控制雜草已成為現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)不可缺少的一部分。但除草劑在消滅雜草的同時也對作物產(chǎn)生了傷害作用。目前，利用基因工程手段培育抗除草劑的作物品種解決了這一矛盾。 廣譜、非選擇性除草劑Basta的活性成分是草丁膦(Phosphinothricin)。草丁膦除草作用機(jī)理是抑制植物的氨基酸生物合成酶—谷氨酰胺合成酶(GS)，使雜草產(chǎn)生氨中毒。bar基因編碼草丁膦乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶(PAT)，可催化草丁膦的自由氨基乙�；�，從而使除草劑草丁膦失活。而且bar基因也是迄今為止應(yīng)用最為廣泛的一個抗除草劑選擇標(biāo)記基因，，克隆出bar基因?qū)χ参锏倪z傳轉(zhuǎn)化，基因表達(dá)和生理學(xué)研究都有重要的作用。 本實(shí)驗(yàn)從抗除草劑轉(zhuǎn)基因Bobwhite小麥中，利用PCR克隆的方法擴(kuò)增出bar基因全長，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，鑒定表達(dá)蛋白的活性，將能夠正確編碼PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶的bar基因片段，經(jīng)過適當(dāng)?shù)男揎棙?gòu)建入真核表達(dá)載體。并將此構(gòu)建的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌獲得工程菌，為基因轉(zhuǎn)化及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化做了前提工作。并對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥體系作了初步的研究，為選育出適宜在安徽麥區(qū)種植的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗除草劑小麥新品種做了基礎(chǔ)工作。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明： 1．利用PCR方法對已知序列基因的克隆是簡單有效的方法，但很多因素影響PCR的特異性，其中退火溫度起著關(guān)鍵性作用。本實(shí)驗(yàn)采用了高保真pfu DNA聚合酶，在退火溫度61℃條件下從轉(zhuǎn)基因Bobwhite品種基因組DNA中擴(kuò)增出特異性片段，將此片段插入克隆載體pGEM-7fz(+)，經(jīng)測序和序列分析表明，所擴(kuò)增得到的片段含有bar基因完整的讀碼框，并且序列與GenBank中發(fā)表的序列完全一致。 2．選用pET32a表達(dá)載體和BL21trxB(DE3)宿主菌的原核表達(dá)系統(tǒng)，對擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行表達(dá)鑒定。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白的分子量39.6kDa，目的片段表達(dá)蛋白分子量20.1kDa，與預(yù)計(jì)的分子量20.0kDa相符。并且表達(dá)的蛋白酶(PAT)經(jīng)DTNB比色法鑒定，具有酶活性。 3．為了目的基因在真核生物中有效的翻譯和表達(dá)，通過PCR方法對bar基因起始密碼子ATG旁側(cè)序列進(jìn)行改造。改造后的目的基因克隆于真核表達(dá)載體pBI121，構(gòu)建表達(dá)載體pBI121-bar，通過三親雜交法將真核表達(dá)載體pBI121-bar 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，成功構(gòu)建出工程菌。 4．小麥離體培養(yǎng)中，基因型、培養(yǎng)基激素濃度與外植體類型是影響小麥胚性愈 傷組織誘導(dǎo)和再生頻率的3個主要因素�；蛐偷挠绊懼饕绊懙脚咝杂鷤M 織的發(fā)生頻率，以幼胚為外植體楊麥87158可以達(dá)到sl．35％，而安農(nóng)92484 只能達(dá)到 16．sl％。在所試的品種中對于成熟胚在 2，4D質(zhì)量濃度為 4．omg／L 時出愈率和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到最大值，而對于幼胚不同品種表現(xiàn)有所差 異，其中楊麥871 58和安農(nóng)98005在2，4＊濃度為2．omg幾時胚性愈傷組織誘 導(dǎo)率最高，而安農(nóng)92484則是在4．omg幾時效果較好。同時研究表明不同外植 體不僅影響到出愈率，更主要影響胚性愈傷組織的形成。 5．在轉(zhuǎn)化后抗性愈傷組織篩選中，適應(yīng)的PPT篩選濃度為3刀mg幾，Cef有效抑 菌濃度為 200pg／ml，乙酚丁香酮有效誘導(dǎo)濃度為 100pmol幾，0．5％表面活性劑 Tween20，可以使GUS染色均勻，但并不是T－DNA轉(zhuǎn)移所必需，鹽的濃度對 T－DNA轉(zhuǎn)移影響不大。
【圖文】：

以在酶切位點(diǎn)前加上2一3個保護(hù)堿基。為小麥的基因組為1.7x10’。bp很大，易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，因是單拷貝時就需要較多的模板量，這進(jìn)一步增加了非特異性控制非特異性擴(kuò)增的一關(guān)鍵因素，退火溫度低時，引物與模板上升，所得產(chǎn)物特異性下降，退火溫度越高，所得產(chǎn)物特異性過高致使引物與模板不能結(jié)合，則擴(kuò)增不出任何條帶。因此本退火溫度，進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2一圖5。

以在酶切位點(diǎn)前加上2一3個保護(hù)堿基。為小麥的基因組為1.7x10’。bp很大，易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，因是單拷貝時就需要較多的模板量，這進(jìn)一步增加了非特異性控制非特異性擴(kuò)增的一關(guān)鍵因素，退火溫度低時，引物與模板上升，所得產(chǎn)物特異性下降，退火溫度越高，所得產(chǎn)物特異性過高致使引物與模板不能結(jié)合，則擴(kuò)增不出任何條帶。因此本退火溫度，進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2一圖5。
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：Q78

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王迅婧;漢麗萍;趙驥民;;燕麥遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年07期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王迅婧;燕麥組織培養(yǎng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的燕麥遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[D];東北師范大學(xué);2012年

本文編號：2677553