【摘要】： 丙型肝炎病毒（HCV）基因型/亞型眾多，HCV基因分型對(duì)丙型肝炎的 臨床治療、HCV疫苗研制及鑒定傳染源、追索傳播途徑等都很有意義。而 現(xiàn)有的各種基因分型方法多有不足。利用新興的DNA芯片技術(shù)能對(duì)生物樣 品作快速、平行、高通量檢測(cè)的特點(diǎn)，我們嘗試將其用于HCV的診斷和基 因分型。探針的制備則采用創(chuàng)新性的限制性顯示PCR（Restriction Display PCR，RD-PCR）技術(shù)，本研究探討了該技術(shù)用于探針制備的可行性及效率。 用限制性內(nèi)切酶Sau3A I消化三個(gè)不同亞型的HCV全長(zhǎng)cDNA，所得 的限制性內(nèi)切酶片段與通用接頭相連，通過(guò)10個(gè)選擇性引物進(jìn)行分組（限 制性）PCR，使各片段得以擴(kuò)增并分布于10個(gè)亞組中，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳 分離。切割出凝膠中的單一條帶后作二次PCR甚至三次PCR，得到較純凈 的HCV cDNA限制性片段。對(duì)這些片段用T載體做亞克隆，并測(cè)序鑒 定。以T載體亞克隆質(zhì)粒為模板，快速擴(kuò)增大量基因片段，，純化后即可用于 芯片打印。由三個(gè)不同亞型的HCV全長(zhǎng)cDNA共得到了62個(gè) 200bP～1000bP大小的基因片段，平均每個(gè)亞型約20個(gè)。 RD—PCR技術(shù)最初是為解決差顯技術(shù)中難以解決的假陽(yáng)性而設(shè)計(jì)的， 并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)能有效地降低差異分析時(shí)的假陽(yáng)性。該技術(shù)能根據(jù)基因組（無(wú) 論序列已知或未知）大小的不同設(shè)計(jì)相應(yīng)的分組引物，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行有效 分組。普通的瓊脂糖凝膠電泳即可分離片段，并以常規(guī)PCR反應(yīng)條件就能 大量擴(kuò)增這些片段，其快速簡(jiǎn)便性不言而喻。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：利用限制性 顯示PCR技術(shù)，能較快速得到大量大小相對(duì)均一、適于芯片上分子雜交的 探針。RD—PCR技術(shù)是非常優(yōu)越和實(shí)用的基因片段收集技術(shù)。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類(lèi)號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 馬文麗,鄭文嶺;DNA微集陣列技術(shù)的研究進(jìn)展[J];中國(guó)科學(xué)基金;1999年05期

2 安陽(yáng),楊紹基,姚集魯;廣州地區(qū)丙型肝炎患者病毒基因分型及其與臨床病情的關(guān)系[J];中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1999年01期

本文編號(hào)：2674286