【摘要】： 經(jīng)典的固醇類激素的作用是通過核受體途徑發(fā)揮的。但越來越多的證據(jù)表明，固醇類激素還可通過所謂的膜受體途徑激活胞內(nèi)信號分子而發(fā)揮作用，所以研究固醇類激素的膜受體就顯得特別有意義。 寡霉素敏感相關(guān)蛋白(oligomycin sellsitivity-conferring protein, OSCP)是ATP合成酶／ATP酶的一個亞單位。ATP合成酶／ATP酶是一個跨膜的多亞基復(fù)合體，廣泛存在于線粒體、細菌、葉綠體的胞壁膜上，包括位于膜外的F1、位于膜內(nèi)的FO以及連接二者的OSCP三部分組成。F1是ATP合成酶／ATP酶的活性中心，它可以催化ATP的合成和分解；FO作為質(zhì)子通道，參與光合磷酸化和氧化磷酸化中能量的轉(zhuǎn)化。OSCP作為聯(lián)系FO和F1的橋梁，在生物體能量轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。寡霉索可與OSCP特異結(jié)合，抑制質(zhì)子流通過FO，使ATP的生成受到阻抑。 1996年，Ramirez等分離、純化雌性大鼠腦神經(jīng)細胞膜組分，使其通過填充有雌二醇的親和層析柱，然后將吸附于親和柱上的物質(zhì)洗脫，進行SDS-PAGE。其中只有突觸膜組分的洗脫液經(jīng)過SDS-PAGE后，在23KD(a)處發(fā)現(xiàn)一特異條帶，經(jīng)蛋白質(zhì)測序分析，確定此物質(zhì)為OSCP。表明雌性大鼠神經(jīng)細胞突觸膜上存在有OSCP，并與雌二醇有高度親合力，隨后的實驗進一步證明該蛋白很可能是一種雌激素膜表面受體。另有報道稱，線粒體蛋白ATP合成酶／ATP酶的活性可被雌激素快速抑制，很可能是雌激素通過與OSCP結(jié)合，調(diào)節(jié)質(zhì)子流的跨膜運動，從而調(diào)節(jié)細胞能量代謝。由此可 Sha隊i卜I匕dieaIL下niversityl!le、、，‘，一kfo一卜laster 見，某些情形下，雌激素發(fā)揮其功能與OSCP有著密切關(guān)系，故深入研究 OSCP的結(jié)構(gòu)和功能就有特別的意義。 目的本實驗選取了OSCP基因的開放啟司讀框共684個核首酸序列，進行體 外擴增和克隆，隨后成功地表達出了大鼠的OSCP，為進一步{J};究這一:l丁能 的雌激素膜受體的結(jié)構(gòu)和功能及其作用力一式創(chuàng)造了條件。 方法(l)構(gòu)建大鼠OSCP基因重組質(zhì)粒:分離3周齡雌性SD大鼠腦組 織，提取總R刊A。根據(jù)OSCP基因的開放閱讀框設(shè)砂「合成1對引物。用 RT一PCR方法擴增出編碼OSCP基因的全長序列，分離純化PCR產(chǎn)物，將 其與pGEM一T easy質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化入JM 109感受態(tài)細胞，搖菌婦L增，提 取質(zhì)粒DNA。酶切鑒定，DNA序列分析，用以檢測所克隆的大鼠OSCP基 因重組質(zhì)粒pGEM一T easy一OSCp。 (2)通過基因改造獲取正確的OSCP基因亞組體:通過DNA序列分 析發(fā)現(xiàn)所得克隆發(fā)生J點突變，造成編碼氨基酸的三聯(lián)體密碼子發(fā)生有義突 變。選取兩克隆，采用限制性內(nèi)切酶將發(fā)生突變的部位切除，然后通過 T4DNA連接酶將未突變序列連接起來，經(jīng)酶切鑒定，ONA序列分析，)}J 以證明所獲得的大鼠OSCP基因重組體是否改造成功。 (3)構(gòu)建大鼠OSCP基因的原核表達菌株，并進行蛋自表達及活性柴 定:將正確的OSCP基因重組體亞克隆入融合表達載體PET一28c(+)中，轉(zhuǎn) 化BLZI感受態(tài)細胞，搖菌擴增，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定，檢測是否構(gòu) 建成功大鼠OSCP基因的原核表達菌株P(guān)ET一28。(+)一OSCP。IPTG誘導(dǎo)表達 后，經(jīng)505一PAGE分離所表達出的融合蛋自。隨后通過將SDS一PAGE所分 離出的融合蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，先后川兔抗大鼠OSCP的多克隆 抗血清和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔!gG對峭酸纖維素膜進行封閉，最 后進行X片曝光、顯影、定影的蛋自印跡技術(shù)進行鑒定 S】lanxi入Iedieal Universit、 l】一e認，01長for Master 結(jié)果oscP基因的開放閱讀框全長684bp，根據(jù)其序列設(shè)計的PcR引物包 含了該閱讀框起始密碼子及其終止密碼子后的16bp。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 顯示RT一PCR產(chǎn)物的長度為700bp，與頂J明結(jié)果相符。將RT一PcR產(chǎn)物純 化、連接入pGEM一T easy質(zhì)粒載體，提取質(zhì)粒DNA，酶切結(jié)果提示獲取了 大鼠oSCP基因重組質(zhì)粒pGEM一T easy一oscP。但DNA序列分析結(jié)果提 示，克隆Cl在第99bp處的堿基A突變?yōu)镚，克隆CZ在300bp處缺失一堿 基A。為了糾正上述突變，將克隆CZ下游的部分多克降位點(主要是 EcoRI酶切位點，目的是為下一步亞克隆pGEM一T easy一OSCP中插入片段 與原核表達載體PET一25。(+)的連接準備條科幾)jl]spel+Pstl雙酶切刪 除，然后通過Klenow片段補平、T4DNA連接酶連接，制備得到亞克隆 CZ。再用Sacl以及插入片段，}，，的PPuMI分別共同消化亞克隆CZ和克隆 cl，去掉突變部位重新連接，以制備亞克隆pGEM一T easy一OscP。提取質(zhì) 粒DNA，酶切及ONA序列分析結(jié)果提示，得到一有正確OSCI〕基因序列 的新克隆。然后將有正確序列的新克隆中的插入少日沒亞克隆入原核表達載 體PET一28c(+)，提取質(zhì)粒DNA，酶切結(jié)果提示，構(gòu)建成功了大鼠OsCP 基因的原核表達菌株P(guān)ET一28c(+)一oscl〕。經(jīng)Il，TG誘導(dǎo)表達，12%的SDS- PAGE呈現(xiàn)出一約23KD(a)的特異表達帶，再將融合蛋自轉(zhuǎn)移到硝酸纖纖i:素 膜上，用兔抗大鼠OSCP的多克隆抗血i青及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 lgG檢測，經(jīng)x片曝光、顯影、定影，可見一oSCI，的特異條洲;:。 結(jié)論在國內(nèi)初次克隆了大鼠OSCP基因，并成功構(gòu)建了大鼠OSCP白勺基因 重組質(zhì)粒;通過基因改造成功地進行了大
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R346

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