【摘要】：疫苗為人們所認(rèn)識并開始應(yīng)用已有200多年歷史，現(xiàn)有的疫苗可分為四種類型，一是經(jīng)過減毒處理但仍舊存活的病原體，一般稱作減毒活疫苗；二是已經(jīng)殺死的病原體，稱作滅活疫苗；三是用病原體加工或利用基因工程技術(shù)得到的重組蛋白疫苗；還有一種是基因疫苗。自上世紀(jì)90年代初Wolff和Tang等報導(dǎo)了質(zhì)粒DNA可以誘導(dǎo)針對編碼抗原的免疫應(yīng)答以來，DNA免疫接種已成為疫苗技術(shù)中發(fā)展最快的領(lǐng)域，這一全新的方法被認(rèn)為是疫苗學(xué)最為重要的發(fā)現(xiàn)之一。1994年在日內(nèi)瓦召開的專題會議上將這種疫苗定名為核酸疫苗。核酸疫苗的出現(xiàn)與發(fā)展是疫苗發(fā)展史上的第三次革命。 核酸免疫最常用的載體是質(zhì)粒DNA，借助其自身的啟動子、終止子等以及宿主的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制合成所編碼的蛋白質(zhì)分子。這種蛋白質(zhì)較之在原核生物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近天然分子，，能夠保持天然表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，也可產(chǎn)生細(xì)胞免疫，而且追加免疫可以加強(qiáng)免疫反應(yīng)；很多病原體，如HIV、HBV、流感病毒及瘧原蟲紅外期等的DNA疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。同時，DNA疫苗正在應(yīng)用于腫瘤疫苗及其抗原T、B細(xì)胞表位的測定等。但DNA疫苗存在兩個仍需解決的問題，一是對于DNA疫苗的免疫機(jī)制，仍有許多問題不完全清楚。二是DNA疫苗接種機(jī)體后，因其可長期表達(dá)，這有可能誘導(dǎo)免疫耐受等不良反應(yīng)。 為嘗試解決上述問題，本研究擬應(yīng)用四環(huán)素(tetracycline,Tet)調(diào)控系統(tǒng)建立可調(diào)控的DNA免疫。首先構(gòu)建了惡性瘧原蟲頂 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 端膜抗原1(AMA一1)基因和反式活化因子(tTA或rtTA)基因的 真核表達(dá)質(zhì)粒pTL一8/燦認(rèn)一l和PTL一8/燦認(rèn)一1(rtTA)，并大量制 備這兩種質(zhì)粒及表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制子(tTS)的質(zhì)粒pUHS6一1.以pTL一 8/AMA一1、pTL一8/燦認(rèn)一l(rtTA)和pTL一8/燦認(rèn)一1(rtTA)加 puHs6一1/tTS免疫小鼠后，用四環(huán)素類似物強(qiáng)力霉素 (doxyeyeline，dox)誘導(dǎo)或抑制上述DNA載體內(nèi)AMA一1的表達(dá)， 并分離小鼠血清檢測針對AMA一1抗體的誘導(dǎo)生成情況。pTL一 8/A擬一1和pTL一8八”A一1(rtTA)在沒有被誘導(dǎo)表達(dá)時(僅基礎(chǔ) 表達(dá))，可誘導(dǎo)明顯的免疫應(yīng)答。在以PTL一8/劫認(rèn)一l(rtTA)與 含tTs的pUHs6一共同免疫后，可極大地降低其免疫應(yīng)答。應(yīng)用 dox誘導(dǎo)pTL一8/AMA一1(rtTA)中的AMA一l基因表達(dá)后，又可引 起明顯免疫應(yīng)答. pTL一8/AMA一1(rtTA)附加 pUHS6一構(gòu)成了可調(diào)控的DNA免 疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)的建立將對進(jìn)一步深入研究DNA疫苗的免疫機(jī)制 和調(diào)控基因表達(dá)、減少不良免疫反應(yīng)以及進(jìn)行可精確調(diào)控的基因 治療打下一定的基礎(chǔ)
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文圖2重組質(zhì)粒p幾一8/AMA一1眾TA)的酶切Fig2IdentifieationofpTL一8/AMA一l(tTA)byrestrenzymedigestionDL2000marker;1:P幾一8eutwithPstl+Bglll1020/AMA一1eutwithPstl+Bglll;3:PTL名/AMA一1*eull;4:P幾一8/AMA一1eutwithXbal;5:PTL~8/Anlll+Bglll;M:?DNAeutwithHindlll+EeoRI。2重組質(zhì)粒pTL-S/AMA一1帆TA)的酶切鑒定質(zhì)粒pUHrT62一1經(jīng)翔01和HPal雙酶切出目的片斷n同樣雙酶切的p幾一8刀幻叭A一1你TA)相連，結(jié)果顯示，了質(zhì)粒p幾一8/AMA一1妞TA無

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文e.再于50惻N洲2P0。、300耐NaeLPHS.0200001充分析，以上透析均在4℃進(jìn)行;f.將透析袋中的溶液轉(zhuǎn)人50oml錐形瓶中，加人0.smlNi一NTA，于4℃輕輕混懸1h;9.離心，棄去上清，用401加ffer洗滌兩次傷。耐NaHZPo。300蒯Nael、20蒯imidazoiePHa.0矢h.再用0.501buffer占0惻NaHZPo。、300蒯Nael、2惻imidazolePHS.0)洗脫四次;i·Bradford法定量2.3.2結(jié)果圖示分別為原核表達(dá)質(zhì)粒pET-16b刀幼吸A一1在未誘導(dǎo)、誘導(dǎo)條下以及純化后的SDS~PAGE。純化后蛋白有少量降解的條帶出現(xiàn)
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392

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本文編號：2671793