發(fā)布時間：2020-05-19 16:10

【摘要】：基因轉(zhuǎn)移是指用物理或生物學(xué)的手段，將外源性基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之表達(dá)的一種技術(shù)。逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，可高效穩(wěn)定地向哺乳類細(xì)胞中轉(zhuǎn)入外源性基因。我們應(yīng)用磷酸鈣沉淀法將含有人全長MDR1 cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pHaMDR1／A轉(zhuǎn)到包裝細(xì)胞PA317中，建立了產(chǎn)病毒細(xì)胞，其最高病毒滴度為3.35×10~3CFU／ml，命名為PA317-HaMDR1／A1。分別用上清感染法和共培養(yǎng)法將PA317—HaMDR1／A1產(chǎn)生的病毒顆粒感染NIH3T3和K562細(xì)胞，然后用秋水仙堿篩選出耐藥的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株NIH3T3／MDR1和K562／MDR1，用于各頊實(shí)驗(yàn)。PCR分析基因組DNA，PA317—HaMDR1／A1，NIH3T3／MDR1和K562／MDR1均出現(xiàn)特異的157bp帶。Southern雜交分析，PA317—HaMDR1／A，NIH3T3／MDR1和K562／MDR1基因組中均出現(xiàn)特異的3．4Kb帶。表明了產(chǎn)病毒包裝細(xì)胞PA317—HaMDR1／A已整合有外源性的MDR1 cDNA，，并且能產(chǎn)生具有雙向性感染能力的病毒顆粒。它能感染NIH3T3和K562細(xì)胞，外源性MDR1 cDNA穩(wěn)定地整合在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組DNA中�？筆—糖蛋白單抗免疫組化法顯示，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面P—糖蛋白陽性程度增高，RT—PCR分析，NIH3T3／MDR1特異的157bp MDR1 cDNA帶為陽性，而NIH3T3為陰性；K562／MDR1特異的157bp帶掃描密度為K562的7.0倍(β2—微球蛋白的cDNA PCR產(chǎn)物為對照)。表明了整合在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的外源性MDR1 cDNA不論是在mRNA還是在蛋白水平表達(dá)均增高。按人類MDR1 cDNA設(shè)計(jì)的引物在轉(zhuǎn)染的鼠類細(xì)胞的mRNA RT—PCR中能擴(kuò)增出特異的帶，說明了MDR1 mRNA表達(dá)水平增高為外源性MDR1 cDNA表達(dá)的結(jié)果．用計(jì)算機(jī)對實(shí)驗(yàn)所用引物序列與鼠的MDR1 cDNA序列進(jìn)行比較，有意義鏈引物與鼠mdr1 cDNA序列的同源率最高為45％，反意義鏈引物最高同源率為80％，從理論上也證明了MDR1 mRNA水平增高為外源性MDR1 cDNA表達(dá)結(jié)果。MTT法分析，K562／MDR1的耐藥譜為，對阿霉素、柔紅霉素、米托葸醌、足葉乙甙、高三尖酯堿和長春新堿交叉耐藥，其耐藥倍數(shù)分別為7.8、8.1、7.0、2.24、4.86和2.27倍，而對阿糖胞苷無耐藥性。表明外源性MDR1 cDNA表達(dá)的P—gp具有正常功能，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞具有MDR表型。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形態(tài)和生長曲線無顯著改變。 以上結(jié)果表明，我們建立了一株能產(chǎn)生含有MDR1 cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒的雙向性包裝細(xì)胞，PA317—HaMDR／A1，其具有感染各種類型細(xì)胞的能力。用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的MDR1cDNA轉(zhuǎn)染，能使被轉(zhuǎn)染細(xì)胞穩(wěn)定整合和表達(dá)外源性MDR1 cDNA，MDR1mRNA增高，P—gp表達(dá)增高，具有完全的MDR表型，而本身的生物學(xué)特性不發(fā)生明顯政交．以上產(chǎn)病毒細(xì)胞PA317—HaMDR／A1，可用于臨床轉(zhuǎn)染骨髓造血干細(xì)胞，進(jìn)行MDR1基因轉(zhuǎn)移保護(hù)骨髓細(xì)胞的研究，也可轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞，進(jìn)行MDR藥物和致敏劑的篩選。
【圖文】：

因組DN人的s叨hton印跡分析為基因組DNA用EocRI酶切，與MDRIODNAxHT33和K562均無3.DRI/A的包裝細(xì)胞K4b帶，而用磷酸鈣沉淀法P^317一HaMDRI/^1和I/^1產(chǎn)生的病毒顆粒轉(zhuǎn)染的NIHT33加DRI均有所期望的3.4Kb帶.該帶為MRDI相似的帶。結(jié)果進(jìn)一步證明，用攜帶MDRI中的基因組DNA整合有外源性的MDRIPA、K5cDNA用DcNA帶的密度遠(yuǎn)低于PA317一H咖RDIA/1和MDRIDcNA拷貝高于前兩者。DCN^。NPA317一(Kb

/入rDRI和K562/MoRI細(xì)胞MDRlmRN照物(PBR322/Hinfl)2.Mo伙1陰性對照562八xDRI4.K5625.NIH3T3/MoRI紅霉素測定式細(xì)胞儀測定孵育120分鐘時細(xì)胞內(nèi)DNR含3細(xì)胞內(nèi)ONR濃度為6CS.12士145.28，NJH31’DRI斗一環(huán)胞菌素A(e，·eosp。:s。，es人)為619·0濃度低于NxH31’3細(xì)胞內(nèi)DNR濃度。NzH31一3(圖7).提示轉(zhuǎn)染后N1H3)·3細(xì)胞MDRI。DNA內(nèi)DNR滯留減少，而且，P一gp的功能可被cs胞內(nèi)DNR濃度卻無明顯差別〔圖8)，可能與低本身有P一呂p表達(dá)(J’關(guān)。試驗(yàn))/MDRI的耐藥譜(Ml，T法)所示，K562/’&IDRI細(xì)胞對阿霉素、柔紅霉素、米叉耐藥，其耐藥倍數(shù)為7.8、8.1、7.0、2.2弓、峨.86
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：1995
【分類號】：R346

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 姚惠琴,劉復(fù)強(qiáng),丁大成,劉元波,鄧移風(fēng),鄭佳,王天,楊凌;多藥耐藥基因在急性白血病治療過程中的表達(dá)研究[J];北京醫(yī)學(xué);2000年03期

2 崔強(qiáng),趙書平,孫軍山,杜遵民,張立成;環(huán)孢素A逆轉(zhuǎn)難治性白血病多藥耐藥基因的臨床研究[J];白血病;2000年05期

3 許元富,楊純正,熊冬生,邵曉楓,桂福明,卞壽庚;Pgp蛋白在白血病細(xì)胞中的表達(dá)及預(yù)后意義分析[J];白血病.淋巴瘤;2000年06期

4 楊建峰,秦良宜,劉惠杰;多藥耐藥基因表達(dá)檢測在白血病治療中的應(yīng)用研究[J];白血病.淋巴瘤;2001年02期

5 徐建業(yè),周琦,沈平,李福沛,李偉道;用逆轉(zhuǎn)錄─多聚酶鏈反應(yīng)檢測卵巢癌及大腸癌患者多藥耐藥基因的表達(dá)[J];重慶醫(yī)學(xué);1997年01期

6 祝焱,謝兆霞;急性白血病一氧化氮合酶表達(dá)與多藥耐藥的關(guān)系[J];中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2004年01期

7 蹇在伏,陳方平,解勤之,梁湘輝,賴悅云,陳英,梁新文,何群,鄭訓(xùn)針,李衛(wèi)紅;惡性血液病患者M(jìn)DR_1和MRP表達(dá)水平及其意義[J];湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1997年04期

8 張明滿,李德華,嚴(yán)律南,茍興華,趙永恒,蘇芝,黃迎春,韓蕾,趙蘭英,胡海洋;攜反義m rp和m dr1雙耐藥基因的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建與鑒定[J];四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2005年06期

9 石慶之,華建媛,楊桂玲,陳三軍,湯愛萍;急性白血病多藥耐藥性與臨床療效關(guān)系的探討[J];江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2000年01期

10 李秀榮!濟(jì)南市,250011,呂翠霞!濟(jì)南市,250014,宋茂美!濟(jì)南市,250011,焦中華!濟(jì)南市,250011;腫瘤的多藥耐藥及耐藥逆轉(zhuǎn)劑研究[J];腫瘤防治雜志;2000年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 林秀梅;甲基蓮心堿、紅霉素逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞多藥耐藥機(jī)理的研究[D];中南大學(xué);2003年

2 李寧;短干涉RNA特異性抑制K562細(xì)胞肺耐藥相關(guān)蛋白基因表達(dá)的研究[D];中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué);2003年

3 王佚;mdr1基因在兔VX2肝癌化療中骨髓保護(hù)及治療作用的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2004年

4 王天曉;逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的新藥開發(fā)研究[D];吉林大學(xué);2005年

5 陳永兵;Mdr1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2/mdr1的篩選[D];四川大學(xué);2005年

6 黃程輝;拮新康對K562/A02細(xì)胞及難治/復(fù)發(fā)急性白血病細(xì)胞MDR逆轉(zhuǎn)機(jī)理的研究[D];中南大學(xué);2004年

7 盧強(qiáng);1.中國漢族人群中難治性顳葉癲vN與MDR1基因多態(tài)性關(guān)系的研究 2.藥物難治性顳葉癲vN危險因素分析[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2006年

8 梁利波;造血系統(tǒng)特異啟動子調(diào)控的耐藥、耐輻射基因的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2002年

9 劉勇;河豚魚多藥耐藥基因組全長序列和鄰座基因的分析[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1998年

10 劉山鳴;河豚魚BAC文庫的構(gòu)建及鑒定[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1998年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李光耀;環(huán)孢菌素A（CsA）逆轉(zhuǎn)白血病和多發(fā)性骨髓瘤耐藥的研究[D];青島大學(xué);2002年

2 周琦;腫瘤多藥耐藥基因表達(dá)與逆轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)研究及應(yīng)用[D];重慶大學(xué);2002年

3 郭軍;小鼠α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染骨癌細(xì)胞GC9811的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年

4 丁艷芳;As_2O_3與苦參堿聯(lián)合逆轉(zhuǎn)人白血病細(xì)胞K562/ADM阿霉素耐藥及其相關(guān)機(jī)制的研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2003年

5 丁江華;白血病P-gp和Bcl-2表達(dá)及其臨床意義[D];江西醫(yī)學(xué)院;2003年

6 田同德;三七總皂甙體外逆轉(zhuǎn)K562/VCR細(xì)胞多藥耐藥的實(shí)驗(yàn)性研究[D];浙江中醫(yī)學(xué)院;2003年

7 梅英;攜mdr1反義RNA重組腺病毒逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2004年

8 孫剛;咖啡因逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細(xì)胞多藥耐藥的研究[D];青島大學(xué);2004年

9 王斌;多藥耐藥基因?qū)肽氀泻思?xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2004年

10 常宏宇;姜黃素、紅霉素逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞多藥耐藥機(jī)理的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

本文編號：2671147