【摘要】：研制開發(fā)有效的新型抗結(jié)核疫苗，是當(dāng)前結(jié)核病研究的主要目標(biāo)。樹突狀細(xì)胞(DC)表面具有高密度的抗原遞呈分子和共刺激分子，能刺激初始型(na(?)ve)T細(xì)胞大量活化增殖。分枝桿菌Hsp65蛋白(熱休克蛋白)作為免疫優(yōu)勢(shì)抗原，能誘導(dǎo)和增強(qiáng)機(jī)體的抗結(jié)核免疫應(yīng)答。我們用含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因的質(zhì)粒pEGFP-C1作為載體，用結(jié)核桿菌H37Rv株Hsp65 DNA為目的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGHsp65，以其轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，觀測(cè)蛋白表達(dá)。再將其導(dǎo)入DC中，制備新型抗結(jié)核的DC疫苗。 本研究根據(jù)結(jié)核分枝桿菌基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，以人型結(jié)核桿菌H_(37)Rv標(biāo)準(zhǔn)毒力株的總DNA為模板，經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)擴(kuò)增出Hsp65目的基因，將回收的PCR產(chǎn)物和載體pEGFP-C1用限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ、EcoR Ⅰ雙酶切，再用T_4DNA連接酶連接，篩選得到的pEGHsp65陽(yáng)性克隆經(jīng)酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定。用質(zhì)脂體方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞)，在共聚焦顯微鏡下觀測(cè)熒光表達(dá)強(qiáng)弱，，以調(diào)整優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。分別收集pEGHsp65、pEGFP-C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，將其作為模板，加入Hsp65特異性引物進(jìn)行PCR測(cè)定，并在PCR反應(yīng)體系中補(bǔ)加內(nèi)參(β-actin)引物作為對(duì)照。無(wú)菌取小鼠骨髓細(xì)胞，加入細(xì)胞因子rmGM-CSF、rmIL-4培養(yǎng)，第8d收集細(xì)胞分別用光鏡和電鏡對(duì)誘導(dǎo)的DC進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。將空載體質(zhì)粒和重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入DC中，同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48 h后在共聚焦顯微鏡下觀測(cè)熒光表達(dá)的強(qiáng)弱。用MTT比色法檢測(cè)DC疫苗刺激小鼠未致敏脾細(xì)胞的增殖。 結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒pEGHsp65經(jīng)BglⅡ、EcoR Ⅰ雙酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定證實(shí)H_(37)Rv株Hsp65 DNA已插入重組表達(dá)載體pEGFP-C1中；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞，24 h即可觀察出轉(zhuǎn)染細(xì)胞有熒光蛋白的表達(dá)，48 h表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)最多，培養(yǎng)72、96 h表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)有所下降，強(qiáng)度減弱；RT-PCR檢測(cè)到重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中有Hsp65 mRNA的表達(dá);光鏡和電鏡對(duì)誘導(dǎo)的DC進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定。 用MTT比色法檢測(cè)到DC疫苗能引起未致敏脾細(xì)胞增殖。 本課題初步完成了結(jié)核桿菌Hsp65與EGFP融合基因的構(gòu)建及DC疫苗的制備。 為進(jìn)一步觀察其治療結(jié)核病的效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1AgarosegeleleetroPhoresisofPCRProduet

g/L瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察可見(jiàn)重組質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)兩條片段，一條大小為1.6kb(目的基因片段)，另一條大小為4.7kb(載體片段)，表明HsP65DNA己被正確插入到pEGFP一Cl中。(圖3)圖3重組質(zhì)粒pEGHsp65酶切圖譜Fig.3RestrietiveenZymeanalysisoftheeombinantPlasmidPEGHsP65
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 居巍,劉君炎,葉林柏;結(jié)核分枝桿菌pcHSP65真核表達(dá)載體的構(gòu)建及序列測(cè)定[J];武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2002年01期

本文編號(hào)：2665170