【摘要】： 瘧疾目前仍然是嚴(yán)重威脅人類健康的寄生蟲病, 在四種人體瘧原蟲中，惡性瘧原蟲是引起嚴(yán)重瘧疾病癥乃至死亡的主要病原體。由于瘧原蟲抗藥性以及蚊媒抗殺蟲劑的抗性產(chǎn)生，使瘧疾防治面臨嚴(yán)重困難。因此，研制有效的瘧疾疫苗已成為瘧疾防治的重要替代途徑。 由于瘧原蟲的生活史復(fù)雜、抗原具有期特異性和變異性以及宿主MHC限制性，一個(gè)有效的瘧疾疫苗應(yīng)由多期多種抗原組成。本研究旨在構(gòu)建這種多期多價(jià)疫苗并探討其免疫原性。我們實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建了由AMA-1(III)和MSP1-19組成的惡性瘧原蟲紅內(nèi)期融合抗原PfCP-2，并在畢氏酵母中得到了高水平表達(dá)。免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PfCP-2保留一些重要構(gòu)象表位，能在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生較高的抗體滴度，且其免疫血清在體外能完全抑制瘧原蟲的生長。然而，PfCP-2的表達(dá)產(chǎn)物在 SDS-PAGE電泳圖上表現(xiàn)為兩條表達(dá)帶。通過對(duì)兩條帶的N-末端氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)兩條帶的原因是由于其中一條帶N-末端缺失9個(gè)氨基酸殘基。對(duì)此，本研究對(duì)PfCP-2的基因進(jìn)行改建，去除其N末端前9個(gè)氨基酸的編碼序列，產(chǎn)生新的基因定名為PfCP-2.9。該基因在畢氏酵母中的表達(dá)產(chǎn)物表現(xiàn)為一條帶，表達(dá)水平與PfCP-2相近（在1克/升以上）。此外，PfCP-2.9在理化性質(zhì)、免疫原性及免疫血清抑制瘧原蟲生長方面與PfCP-2一致。這表明在N-末端去除9個(gè)氨基酸不影響該融合抗原的免疫原性及其免疫血清的體外抑制作用。這為該疫苗抗原解決了在諸如產(chǎn)品申報(bào)、臨床試驗(yàn)中因兩條表達(dá)帶而帶來的麻煩。 通過比較實(shí)驗(yàn)，本研究結(jié)果顯示：與組成該融合蛋白的兩個(gè)單組分[即AMA-1(III)和MSP1-19]相比，PfCP-2.9具有以下優(yōu)勢：①表達(dá)產(chǎn)量比單組分高20倍；②免疫家兔的抗體滴度分別是兩個(gè)單組分的11倍和18倍；③15%的PfCP-2.9免疫血清能有效抑制瘧原蟲生長，而相同濃度的單組分免疫血清無抑制作用。這表明將兩個(gè)單組分融合為一個(gè)分子后，其表達(dá)量、免疫原性以及免疫抑制作用均有顯著提高。 為了構(gòu)建一個(gè)有效的多期多價(jià)瘧疾疫苗，在PfCP-2.9基礎(chǔ)上增加紅外期抗原。對(duì)此，本研究構(gòu)建了另外3個(gè)紅前期抗原。這些抗原包括：①PfCP-3tcl：它由惡性瘧原蟲紅前期CSP、TRAP和LSA-1抗原中主要T、B細(xì)胞表位融合而成；② WP=5 PfCSP-1：由惡性瘧原蟲CSP抗原的C-末端序列組成；③PfCSP-2由惡性瘧原蟲CSP抗原中區(qū)域I、15個(gè)四肽重復(fù)區(qū)和全部C-末端序列組成。以上3個(gè)抗原均從基因水平設(shè)計(jì)和合成，并選用畢氏酵母密碼子和排除抗原中糖基化位點(diǎn)。3個(gè)合成基因均能在畢氏酵母系統(tǒng)中進(jìn)行分泌表達(dá)，產(chǎn)量均在1克/升以上，高的可達(dá)4克/升。純化蛋白均采用陽離子交換和分子篩兩步法，獲得純度在95%以上的重組蛋白。 將3個(gè)純化蛋白分別與PfCP-2.9進(jìn)行聯(lián)合免疫，測定針對(duì)各抗原的抗體滴度，，并與單個(gè)抗原免疫的抗體滴度比較。結(jié)果顯示：PfCP-3tcl與PfCP-2.9聯(lián)合免疫的抗體滴度均比單個(gè)抗原免疫的滴度有明顯下降，可能存在抗原競爭性抑制作用；而PfCSP-1和PfCSP-2分別與PfCP-2.9聯(lián)合免疫后均未發(fā)現(xiàn)有明顯的競爭性抑制作用，其抗體滴度與單抗原免疫血清相當(dāng)或有所上升。這樣，本研究結(jié)果初步表明，PfCSP-1或PfCSP-2可與PfCP-2.9組成多期多價(jià)聯(lián)合疫苗。對(duì)該多期多價(jià)瘧疾疫苗的進(jìn)一步試驗(yàn)(包括恒河猴試驗(yàn))目前正在進(jìn)行和安排之中
【圖文】：

PfCP-2.9/pPIC9K圖 3 PfCP-2.9 基因的構(gòu)建示意圖列 B PfCP-2.9 基因的合成 C PfCP-2.9 基因的克隆XhoI+EcoRBamHI+EcoRIPfCP-2.9/pBluescript KSDNA 序列分析XhoI+EcoRIPfCP-2.9/pPIC9H

所示途徑構(gòu)建了AEM-I(I工I)和}ISPI-1}兩個(gè)蒸因
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2664707