【摘要】： HBV感染是一個(gè)世界范圍的衛(wèi)生問題。相當(dāng)一部分的乙肝病毒感染者，會(huì)遷延轉(zhuǎn)變成慢性肝炎、肝硬化或肝癌。盡管乙肝疫苗可以預(yù)防其感染，但現(xiàn)有的數(shù)目龐大的感染人群、約50％的對(duì)疫苗不反應(yīng)者以及可能的逃避疫苗誘導(dǎo)免疫的乙肝病毒突變株都迫切需要有效的治療手段。對(duì)慢性乙型肝炎感染者的治療，α干擾素其有效率不高(約為30％-40％)，耐受性差。核苷類似物包括lamivudine、famciclovir、lobucavir、adevfovir停藥后大多數(shù)患者的病情會(huì)復(fù)發(fā)，而長期用藥又會(huì)導(dǎo)致耐藥株的出現(xiàn)。反義技術(shù)及核酶(ribozyme)治療乙肝目前尚處于實(shí)驗(yàn)研究階段。但反義寡核苷酸制備昂貴，難以大量合成應(yīng)用于臨床治療�？傊F(xiàn)有的各種手段對(duì)于預(yù)防和治療乙肝病毒的感染有一定的效果，但仍迫切需要探索治療的新方法。1991年，Natsoulis和Boeke在Nature雜志首次提出一種新的抗病毒的策略：核衣殼導(dǎo)向的病毒滅活(capsid-targeted viral inactivation,CTVl)并將其應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)錄病毒的實(shí)驗(yàn)治療。乙肝病毒的復(fù)制過程類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒，即首先將其DNA轉(zhuǎn)錄成前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)，然后DNA多聚酶與核心蛋白分子將其包裹形成核心顆粒，在核心顆粒內(nèi)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄與DNA的正鏈合成，完成病毒基因組的復(fù)制。針對(duì)乙肝病毒的復(fù)制特點(diǎn)，我們著手將CTVI用于抗乙肝病毒感染的研究：以乙肝病毒的核心蛋白為靶向分子，利用它們對(duì)乙肝病毒pgRNA的特異識(shí)別與包裹，使與靶向分子融合表達(dá)的效應(yīng)分子——核糖核酸酶特異地與乙肝病毒pgRNA結(jié)合并切割，抑制乙肝病毒的復(fù)制。 首先，以Trizol提取HL-60細(xì)胞中的總RNA。應(yīng)用RT-PCR，擴(kuò)增核糖核酸酶[人嗜酸性粒細(xì)胞來源的神經(jīng)毒素(hEDN)]編碼基因，，克隆入puc18并測序。而后，以Trizol提取整合乙肝病毒的2.2.15細(xì)胞中的總RNA，RT-PCR擴(kuò)增乙肝病毒核心蛋白(HBVc)編碼基因。將擴(kuò)增的hEDN及HBVc編碼基因克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)構(gòu)建融合真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)／hEDN-HBVc，即乙肝病毒靶向核糖核酸酶真核表達(dá)載體。同時(shí)分別PCR擴(kuò)增出包含乙肝病毒核心蛋白、人類嗜酸性粒細(xì)胞來源的神經(jīng)毒素、以及突變失活的人 第四軍醫(yī)大學(xué)碩土學(xué)位論文 中文擴(kuò)曇 類嗜酸性粒細(xì)胞來源的神經(jīng)毒素編碼基因的真核表達(dá)載體PCDNA3．l卜） fIBVcalone、pcDNA3．1（－）MIDNalone、pcD＊A3．l（）’hEDNmut－HBVc作為對(duì) 照。將擴(kuò)增的hEDN編碼基因克隆入原核表達(dá)載體pGEX4T刁，構(gòu)建原核表達(dá) 載體pGEX4T八／hEDN。將陽性克隆在 ECOli BLZI中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化產(chǎn)物 ］免疫BaLB／。小鼠制備抗體，滴度1：400時(shí)做＼＼sstem blot鑒定，在M為16 000 的位置處有一條明顯的帶。pCDNA3卜）lffi＊C－h(huán)EDN轉(zhuǎn)染 2．ZIS細(xì)胞后，以自 制的鼠抗hEDN作為一抗，進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染 pcDN’A3千帥DN邢VC的22刁 細(xì)胞出現(xiàn)較強(qiáng)綠色熒光，說明pcDNA31卜） ／hEDN－HBVC可以在22＊ 細(xì)胞內(nèi)較高表達(dá)。轉(zhuǎn)染pCDNA31（－）／hEDN－HBVC、 三種陰性對(duì)照質(zhì)粒及pcDNA3卜斤22 15細(xì)胞同時(shí)設(shè)立空轉(zhuǎn)染為全陰性對(duì)照， 轉(zhuǎn)染后48小時(shí)提取部分上清，應(yīng)用固相放免定量分祈HBSAg含量，結(jié)果顯示， 轉(zhuǎn)染pcDNA3（－）／hEDN－HBVC組H’bSAg比正常培養(yǎng)的2215細(xì)胞上清下降 58％。而其他對(duì)照表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與正常培養(yǎng)的 22is細(xì)胞上清 HBSAg含量差 別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞做＊y T比色分析，細(xì)胞增殖并沒有受抑制， 而且各組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RTPCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)染基因結(jié)果說明 pcDNA3．l個(gè)） fIBV卜hEDN轉(zhuǎn)染組 HBSAg含量下降系由含靶向分子（HBVG）和效應(yīng)分子 （hEDN）的融合蛋白作用導(dǎo)致的，即靶向核糖核酸酶具有抗HBV的作用。 以上結(jié)果表明，由于 pCDNA3個(gè)）怔DN－HBVC帶有特定的靶向分子和高效 的效應(yīng)分子，在靶向分子自動(dòng)包裝HBV p酬A將效應(yīng)分子帶入核衣殼內(nèi)效應(yīng) 分子可以特異性的切割 HBV pgRNA，從而抑制 HBV的復(fù)制。研究結(jié)果表明己 初步成功地探索了治療乙肝病毒感染的新途徑。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 許正鋸,王崇國,李旭紅,楊紅,張啟華;干擾素抗體與干擾素α-2a治療慢性乙型肝炎療效的關(guān)系[J];中華傳染病雜志;1998年03期

本文編號(hào)：2661182