【摘要】： 目的 組織工程骨體外構(gòu)建的研究已經(jīng)很多，但是所利用的細(xì)胞外支架和天然的骨組織相比，仍有許多不足。骨脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)(AECM)是利用物理和化學(xué)的方法對(duì)骨組織進(jìn)行處理而得到的無細(xì)胞的天然細(xì)胞外基質(zhì)，其結(jié)構(gòu)與天然骨組織十分相似。雖然，一些人描述了骨脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的特性，說明它是一種較好的細(xì)胞外支架，但迄今為止還沒有見到骨脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)作為支架與種子細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的詳細(xì)報(bào)道。成骨細(xì)胞是骨形成中必不可少的細(xì)胞，在體外具有培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便、容易獲得和擴(kuò)增迅速的特性，是骨組織工程種子細(xì)胞的理想選擇，但是對(duì)于它的成骨特性卻未見較全面的描述。本實(shí)驗(yàn)以長(zhǎng)骨干成骨細(xì)胞為種子細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)并觀察以及在體外與骨重組脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，旨在為骨組織工程篩選種子細(xì)胞奠定基礎(chǔ)，為組織工程骨體外構(gòu)建提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法 1．動(dòng)物wistar大鼠15只，體重180—200克左右，雌雄不限(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供) 2．試劑DMEM(GIBCO／BRL)、胰酶(DIFCO)、小牛血清(TDB生物制品公司)、Collagen type Ⅰ抗體(武漢博士得生物制品公司) 3．骨重組脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)(Reconstructed Acellular Extra Cellular Matrix，REAECM)的制備 用1％的戊巴比妥鈉(1.0ml／只)將5只wistar大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，取雙側(cè)脛骨中段。鋸成若干段以后，剔除骨膜，，PBS徹底清 洗。向廣口瓶中加人 0．05 M TiS－HCLhH7．4）緩沖液，緩沖液內(nèi) 加人蛋白酶抑制劑N．1吩d鄧］ollilll．5伶d fenP…＊，o· 6pyInl pepstatinA人放人骨片4t下恒溫震蕩4天。然后把瓶?jī)?nèi) 液體換成內(nèi)含3％TritonX－100的 TiS－HCLhH7．4）緩沖液，同 樣也加人上述蛋白酶抑制劑，斗℃下恒溫震蕩7天后，用蒸餾水連 續(xù)沖洗。之后加人DNAse和NAse混合液室溫下消化12 ／J＼時(shí)。 再次向瓶中加人內(nèi)含 3％TritonX河 的 TiS－HCL帥H7．4）緩沖 液，4℃下恒溫震蕩7天。蒸餾水充分沖洗后，將制備的骨脫細(xì)胞 細(xì)胞外基質(zhì)（AECM）放人Von Ebnel氏脫鈣液脫鈣30天后，放人 內(nèi)含4萬單位慶大霉素的PBS液中，4℃下保存?zhèn)溆�。收集AECM 于燒杯中，剪碎，勻漿機(jī)打碎，離心后棄去上清，將殘留物放人24 孔培養(yǎng)板的孔內(nèi)，令其自然沉降干燥，制成骨的REAECM，然后放 人90％的酒精中48小時(shí)后，紫外線照射3天備用，部分作光鏡、掃 描電鏡觀察。 4．成骨細(xì)胞培養(yǎng)及生物學(xué)活性檢測(cè) 取 10只 wistar大鼠的雙側(cè)股骨中段，剝除骨膜，剪成 Inun x 1＊m大小的組織塊兒，放人0．25 ％的胰酶中，37℃的恒溫水浴消 化30分鐘，連續(xù)5次，更新胰酶消化液，4℃冰箱中消化，過夜。再 次更換胰酶消化液，37℃再消化2小時(shí)，將組織塊取出移人培養(yǎng)瓶 中，加人含 10％小牛血清的 DMEM，浸沒，放人 37℃3％CO。培養(yǎng) 箱中，隔日換一次液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶時(shí)，用0．25％的胰酶消化傳 代，取第四代細(xì)胞行MM法繪制生長(zhǎng)曲線、HE、Mallory葉eiden－ ham快速一步法、黃素紅S、鈣一鉆法堿性磷酸酶染色以及免疫組 化SP法檢測(cè)1型膠原。 5．成骨細(xì)胞和骨REAECM體外聯(lián)合培養(yǎng) 無菌條件下．用 0．25％的胰酶消化液消化第四代的成骨細(xì) 胞，收集制成 IX 10‘什Inl的 DMEM細(xì)胞懸液。取 12孔培養(yǎng)板， 將4塊已消毒備用的骨的REAECM放人孔中，每個(gè)孔中放人細(xì)胞 ·2· 懸液 lrnl，讓成骨細(xì)胞充分滲人骨的 yAECM孔隙中，放人 37 t， 5％CO。的培養(yǎng)箱中，6小時(shí)后更換培養(yǎng)液，以后每?jī)商鞊Q一次液。 6．聯(lián)合培養(yǎng)的組織學(xué)觀察 聯(lián)合培養(yǎng)1周后，將骨REAECM取出。部分骨REAECM以 10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，行HE染色。部分骨RE－ AECM以 2．5％戊H醛固定，作掃描電鏡觀察。 結(jié) 果 二．骨REAECM的組織學(xué)觀察 光鏡下，和正常的骨組織HE切片相比較，骨脫細(xì)胞細(xì)胞外基 質(zhì)（AECM）膠原纖維排列整齊，橢圓形骨陷窩內(nèi)空虛，無骨細(xì)胞核 及其他結(jié)構(gòu)。經(jīng)物理處理的骨的REAECM掃描電鏡觀察僅見骨 基質(zhì)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)已經(jīng)消失，骨陷窩空虛，骨陷窩內(nèi)壁光滑規(guī)則， 無任何細(xì)胞殘留物，而且骨REAECM具有不規(guī)則的孔隙一網(wǎng)架結(jié) 構(gòu)，孔隙直徑為 100－400卜m，孔壁欠光滑，孔隙率高，這與 RE－ AECM的HE染色的結(jié)果是一致的。 2．成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)特性及組織學(xué)觀察 骨組織塊消化后浸泡于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，24小時(shí)后，開始有細(xì)胞出 現(xiàn)；以后，細(xì)胞不斷從骨塊中爬行出來，可見細(xì)胞呈梭形、鱗片狀或 三角型。培養(yǎng)3周后，可見明顯的集落形成。集落中的細(xì)胞不斷 擴(kuò)增，呈放射狀向周圍擴(kuò)展。傳代細(xì)胞自 2－6h開始貼壁，12－ 14h大部分開始分裂生長(zhǎng)，與原代細(xì)胞相似，46天即可長(zhǎng)滿培養(yǎng) 瓶。成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶染色為強(qiáng)陽(yáng)性，黃素紅染色陽(yáng)性，而 免疫組化和nanory一nei咖nnatn快速一步法結(jié)果是一致的。 3．成骨細(xì)胞和骨的REAECM聯(lián)合培養(yǎng)的光鏡觀察 聯(lián)合培養(yǎng)1周的組織學(xué)切片顯示，在骨的REAECM的孔隙 中，有成團(tuán)的藍(lán)染的成骨細(xì)胞，有的細(xì)胞沿著骨REAECM排列
【圖文】：

細(xì)胞周圍有小突起(圖12)。2.3.6免疫組化檢測(cè)結(jié)果:I型膠原在細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)，表現(xiàn)為胞漿呈棕黃色。細(xì)胞外出現(xiàn)棕黃色的物質(zhì)，以鈣結(jié)節(jié)處最明顯(圖13)，這與Mallory一heidenhain快速一步法染色的結(jié)果是一致白勺。3.成骨細(xì)胞和骨REAECM的聯(lián)合培養(yǎng)的組織學(xué)觀察HE染色可見成骨細(xì)胞散在分布于骨REAECM中，有的沿著骨REAECM的排列，有一定的規(guī)律，并發(fā)生變形，有的進(jìn)人骨RE-AECM的孔隙中，沿其邊緣排列(圖14)。掃描電鏡下可見成骨細(xì)胞緊密貼附于骨的REAECM上(圖巧)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 盧衛(wèi)忠,唐康來;TGF-β對(duì)成骨細(xì)胞的作用[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年01期

2 王華,黎海芪,楊錫強(qiáng),瞿平,劉瑜;大鼠長(zhǎng)骨成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)形態(tài)觀察[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年05期

3 張寶燕,鄒仲之,劉小蓉,樸英杰;含人發(fā)角蛋白的真皮類似物促進(jìn)真皮修復(fù)[J];解剖學(xué)研究;2002年04期

4 魏寬海;組織工程化骨組織中成骨細(xì)胞來源的選擇[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(創(chuàng)傷與外科基本問題分冊(cè));1998年03期

5 田偉,柏樹令;成骨細(xì)胞的成骨作用及復(fù)合移植研究進(jìn)展[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2002年04期

6 沙鏑,姜英令,高景恒,呂永利;豬長(zhǎng)骨脫細(xì)胞骨細(xì)胞外基質(zhì)的制備及生物力學(xué)、組織學(xué)性質(zhì)的初步檢測(cè)[J];實(shí)用美容整形外科雜志;2000年06期

7 鄭磊;骨組織工程基質(zhì)材料的現(xiàn)狀及展望[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2001年03期

8 郭昭慶，黨耕盯，王志國(guó);成人成骨細(xì)胞培養(yǎng)[J];中華骨科雜志;1995年09期

9 宋守禮,朱盛修,張伯勛,黃靜香;經(jīng)皮注射自體骨膜細(xì)胞修復(fù)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華骨科雜志;1997年11期

10 梁戈,胡蘊(yùn)玉,鄭昌瓊,冉均國(guó),王士斌;多孔β-TCP/BMP復(fù)合人工骨的研制和動(dòng)物體內(nèi)的相關(guān)研究[J];中華骨科雜志;1998年02期

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