【摘要】：目的 組織工程為創(chuàng)傷、腫瘤、嚴(yán)重感染等造成的大段骨缺損的修復(fù)提供了新的治療方法。隨著臨床上組織工程應(yīng)用的推廣,種子細(xì)胞的來源成為人們重點(diǎn)研究的問題。hMSCs是目前較為理想的組織工程種子細(xì)胞來源,但不同年齡的hMSCs體外增殖、分化特點(diǎn)有很大差異。不同年齡供體的hMSCs生長特性是否存在差異以及高齡供體hMSCs是否能滿足修復(fù)自身骨缺損的需要尚缺少系統(tǒng)的研究,本實(shí)驗(yàn)通過對人不同年齡段樣本的研究,觀測了各年齡段樣本的種子細(xì)胞體外增殖、成骨分化以及裸鼠皮下成骨能力,為下一步組織工程骨修復(fù)骨缺損的臨床應(yīng)用提供參考。 方法 1、年齡分組:樣本來自39例7～79歲健康志愿者骨髓,按人骨骼發(fā)育和激素分泌水平分為20(9例),20～39(10例),40～60(11例),60(9例)四組。2、獲取健康志愿者骨髓,分離hMSCs進(jìn)行原代、傳代和誘導(dǎo)培養(yǎng),記錄單個(gè)核細(xì)胞獲取數(shù)、傳代時(shí)間、細(xì)胞收獲數(shù)、倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。3、取樣進(jìn)行細(xì)胞透射電鏡觀察。4、取第2代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。5、取第2代細(xì)胞5×103/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板,于第1～8天每天用MTT法分析骨髓基質(zhì)細(xì)胞的存活和增殖能力。6、取第2代hMSCs以1×105/ml接種于6孔培養(yǎng)板,加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,分別于2、4、6、8、10、12、14天消化細(xì)胞,進(jìn)行ALP活性檢測。7、取第2代細(xì)胞爬片,進(jìn)行ALP、I型膠原和骨鈣素免疫組化及鈣染色。8、取第2代5×104/ml hMSCs 2ml以接種于6孔培養(yǎng)板, 于第4天和第8天換液前取培養(yǎng)基1ml,用放免法定量檢測骨鈣素含量。9、每個(gè)年齡組隨機(jī)抽取2個(gè)樣本,取第2代hMSCs用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng),將誘導(dǎo)后的細(xì)胞復(fù)合人脫鈣骨(DBM)種入裸鼠皮下。分別于第4、8、12星期進(jìn)行X攝片、HE及免疫組化染色并進(jìn)行圖像分析。 結(jié)果 1.低齡組(20)樣本細(xì)胞較高齡組(60)形態(tài)好、傳代時(shí)間短、增殖能力強(qiáng),但各年齡組細(xì)胞數(shù)量均能滿足組織工程骨構(gòu)建的需要。2.低齡組與高齡組樣本的原代細(xì)胞、誘導(dǎo)后細(xì)胞在電鏡下無明顯區(qū)別。3.細(xì)胞周期分析顯示,低齡組樣本較高齡組樣本增殖期細(xì)胞比例高、靜止期細(xì)胞比例低、凋亡率較低,低齡組與高齡組 基金項(xiàng)目:國家863計(jì)劃資助項(xiàng)目(2003AA205002) WP=8 存在非常顯著性差異(P0.01)。4.MTT法結(jié)果顯示低齡組樣本增殖能力和活性較高齡組高,低齡組與高齡組存在非常顯著性差異(P0.01)。5.誘導(dǎo)后各年齡組細(xì)胞ALP、I型膠原和骨鈣素免疫組化及鈣染色呈陽性反應(yīng),未誘導(dǎo)細(xì)胞染色呈陰性反應(yīng)。6.低齡組樣本誘導(dǎo)細(xì)胞ALP活性較高齡組高,低齡組與高齡組存在非常顯著性差異(P0.01)。7.第4天和第8天成骨誘導(dǎo)上清液骨鈣素濃度隨著年齡的增長而呈下降趨勢,低齡組明顯高于高齡組,低齡組與高齡組存在非常顯著性差異(P0.01)。8.植入裸鼠皮下的組織塊在X片中的顯影密度隨時(shí)間的增加而增高,低齡組樣本呈高密度顯影。 12周時(shí)組織切片HE染色顯示低齡組皮下組織塊有骨組織形成,60歲以上組樣本組織塊內(nèi)有大量成骨細(xì)胞,有少量組織礦化。9. 免疫組化染色圖像分析結(jié)果顯示低齡組與高齡組皮下組織塊I型膠原和骨鈣素表達(dá)存在非常顯著性差異(P0.01)。 結(jié)論 1.取得了各年齡組hMSCs培養(yǎng)的時(shí)間、密度參數(shù)。2.不同年齡組之間增殖、成骨分化的差異具有顯著性意義,隨著年齡的增長其增殖、成骨分化能力也相應(yīng)降低。3.hMSCs成骨誘導(dǎo)后具有成骨細(xì)胞活性表達(dá)。4.低齡組樣本在裸鼠皮下能成骨,其成骨能力大于高齡樣本,60歲以上組樣本成骨能力低下,所需時(shí)間長,不能很好達(dá)到臨床修復(fù)骨缺損的要求。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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