【摘要】：細(xì)胞色素P450是一類能與CO結(jié)合，形成的復(fù)合物在450nm附近具有最大吸收峰的血紅蛋白的總稱。細(xì)胞色素P450nor是一類獨(dú)特的細(xì)胞色素P450，它在真菌反硝化中扮演著重要的角色。P450nor起著一氧化氮還原酶的作用，能以NAD(P)H為直接電子供體將NO還原成N_2O。雖然它屬于P450超家族，但沒有加單氧酶的活性。迄今為止，已從真菌和酵母中克隆了多種P450nor基因，表明其存在的普遍性。本研究將真菌細(xì)胞色素P450nor基因克隆到高效表達(dá)載體pET-28的BamH Ⅰ／HindⅢ位點(diǎn)，得到重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-p450nor，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得高效表達(dá)真菌細(xì)胞色素融合蛋白His-P450nor。SDS-PAGE蛋白電泳表明在43kD處出現(xiàn)強(qiáng)特異帶。His-Tag柱在2.5h內(nèi)一步純化可溶性融合蛋白20.8mg，，純化融合蛋白注射雄性新西蘭大白兔可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體。Westernblot和ELISA檢測結(jié)果顯示，該抗體與表達(dá)的融合蛋白呈陽性反應(yīng)，效價(jià)在64，000以上。純化的融合蛋白His-P450nor能通過催化NO來抑制腫瘤細(xì)胞SSMC-7721腫瘤細(xì)胞的生長。 利用Bac-to-Bac桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)將真菌細(xì)胞色素P450nor基因克隆到轉(zhuǎn)移載體pFastBacl中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac-P450nor。再將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入含穿梭載體Bacmid的受體菌DH10Bac中發(fā)生轉(zhuǎn)座作用，得到含P450nor基因的重組穿梭載體rBacmid pAc-P450nor。分離提取重組Bacmid DNA，并轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞Sf9，得到重組病毒rAc-P450nor。經(jīng)酶切和PCR鑒定，細(xì)胞色素P450nor基因正確地插入到病毒基因組的多角體蛋白基因啟動子下。SDS-PAGE分析證明：表達(dá)蛋白的分子量為43kD左右。Western blotting分析結(jié)果表明：有一條特定的雜交帶存在，且分子量相同(約43 kD)。進(jìn)一步證明了含有真菌細(xì)胞色素P450nor基因的重組表達(dá)載體和重組病毒構(gòu)建成功，并在昆蟲細(xì)胞Sf9中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。經(jīng)MTT法測定表達(dá)的細(xì)胞色素P450nor具有還原NO的生物學(xué)活性。
【圖文】：

回收P4SOnor基因片段，同時回收命扭廳I/Hz’刀d工H雙酶消化的原核表達(dá)質(zhì)粒載體pET28，然后將回收的P450nor基因片段分別與載體pET28用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pET一P450nor(圖1，圖2)。表達(dá)質(zhì)粒pET一28a、b、C是一套含有不同閱讀框的表達(dá)質(zhì)粒，分別長5369、5368、5367bP。帶有Kan抗性基因、T7啟動子、T7終止子、七ac工調(diào)控基因和多克隆位點(diǎn)。這兩種質(zhì)粒都可以很方便地克隆任一外源基因，使其與T7啟動子啟動的細(xì)菌蛋白編碼區(qū)引導(dǎo)序列同框，并且緊靠T7啟動子引入了6個His的編碼序列，這樣，表達(dá)的融合蛋白在N端帶有6個His，可以通過鰲合鎳離子親和層析柱快速純化表達(dá)蛋白，有利于表達(dá)蛋白的分離純化和功能研究。3.1.2重組表達(dá)質(zhì)粒pET一P450nor的鑒定構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET一P45Onor轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用Kan平板篩陽性克隆

500，250，功O2:命盈廳I/H1’nd111酶切鑒定pET一P450nor3:PET一P450nor32;42.0以打腸430-1l.0月Jf‘圖3!l峨4P450nor蛋白純化前后的SDS一PAGE分析:Ni一NTA
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：Q785

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本文編號：2656329