【摘要】：瘧疾是嚴(yán)重危害人類健康的蟲(chóng)媒傳染病，廣泛流行于熱帶和亞熱帶一些發(fā)展中國(guó)家。瘧疾的診斷是瘧疾防治工作中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，當(dāng)前瘧疾的發(fā)病率和死亡率難以控制的一個(gè)重要原因就是在瘧疾流行區(qū)缺乏有效的診斷和治療手段。傳統(tǒng)的瘧疾診斷方法由于操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴、需專業(yè)人員因而難以在基層推廣。近年來(lái)發(fā)展的以單克隆抗體為基礎(chǔ)的免疫層析技術(shù)，以其快速、簡(jiǎn)便、可靠等優(yōu)點(diǎn)在瘧疾診斷中顯示了廣闊的應(yīng)用前景，目前國(guó)外公司已開(kāi)發(fā)出ParaSight-F(Becton Dickinson, Cockeysoville, Maryland, USA)、ICT Malaria P.f和ICT Malaria P.f／P.v(ICT Diagnostics, Sydney, Australia)、OptiMAL(Flow Inc, Portland Oreg)等一系列基于免疫層析的診斷試劑盒，現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估取得較好的效果。但這些試劑盒價(jià)格昂貴，且均存在一定的局限性，因而有必要尋找一種更具有診斷價(jià)值的新型靶抗原。 惡性瘧原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase, GDH)是瘧原蟲(chóng)物質(zhì)和能量代謝過(guò)程中一種十分重要的功能分子，對(duì)碳、氮代謝起重要作用，在瘧原蟲(chóng)整個(gè)紅內(nèi)期均能表達(dá)，它催化谷氨酸脫氨基生成α-酮戊二酸，同時(shí)使輔酶Ⅰ、Ⅱ由氧化型(NAD~+、NADP~+)轉(zhuǎn)化為還原型(NADH、NADPH)。研究揭示，瘧原蟲(chóng)GDH同脊椎動(dòng)物組織的GDH在理化、生物學(xué)特性及酶學(xué)方面有較大差異，如瘧原蟲(chóng)GDH活性不受嘌吟核苷酸(GTP、ADP)的影響，而脊椎動(dòng)物組織的GDH可被GTP、ADP激活或抑制。瘧原蟲(chóng)GDH特異地以輔酶Ⅱ?yàn)槠漭o酶，而脊椎動(dòng)物組織的GDH可以輔酶Ⅰ或Ⅱ作為輔酶。臨床和實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)表明，瘧原蟲(chóng)比其宿主 細(xì)胞更易受氧化壓力影響，因此參與琉基代謝及還原型輔酶ll(NADPH) 再生的脫氫酶對(duì)于瘧原蟲(chóng)免受宿主體內(nèi)氧化劑損傷及維持生存起著極其 重要的作用。瘧原蟲(chóng)GDH被認(rèn)為是NADPH生成的主要來(lái)源，而且更為 重要的是宿主紅細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有此酶(GDH.NADP+)。序列分析表明，來(lái)源 于惡性瘧原蟲(chóng)海南株(FCCI似N)的GDH同泰國(guó)(Thailand)株GDH 同源性高達(dá)99%。此外，瘧原蟲(chóng)GDH與低等真核生物、真菌、細(xì)菌的 同源性約為50%，而與人的GDH的同源性僅為23%。盡管目前沒(méi)有間 日瘧原蟲(chóng)GDH基因的有關(guān)報(bào)道，但從進(jìn)化角度來(lái)看，它同間日瘧原蟲(chóng)的 GDH可能存在非常高的同源性，提示該酶有望成為一種同時(shí)對(duì)惡性瘧和 間日瘧快速診斷的新型靶抗原。 本研究的最終目標(biāo)是建立以GDH為診斷靶分子的免疫層析技術(shù)，使 該技術(shù)同時(shí)可對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)進(jìn)行診斷，因此，獲得同時(shí)針 對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)的單克隆抗體是建立該技術(shù)的關(guān)鍵，而一個(gè) 具有完整空間表位的重組GDH分子是建立該技術(shù)的基礎(chǔ)。因而本研究在 已構(gòu)建的GDH融合蛋白表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，通過(guò)分子克隆技術(shù)構(gòu)建了非 融合蛋白表達(dá)載體，并分別在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)復(fù)性和柱層析 技術(shù)分別純化了融合蛋白和非融合蛋白，在此基礎(chǔ)上采用雜交瘤細(xì)胞技 術(shù)制備了針對(duì)兩種蛋白的單克隆抗體，并對(duì)抗體進(jìn)行了初步鑒定。同時(shí) 結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)建立了膠體金免疫層析測(cè)試法，并 以鏡檢法為參照，評(píng)價(jià)其檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)的敏感性和特異 性。 結(jié)果顯示，融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pGEX一4T一1/GDH在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn) 物主要以包涵體形式存在，重組蛋白分子量約為66KDa，表達(dá)量約占菌 體蛋白的25%，將包涵體進(jìn)行變性/復(fù)性，，利用二步陰離子交換層析純化 重組蛋白，純度約達(dá)90%。用鼠抗GDH免疫血清進(jìn)行節(jié)幾stem一blot分析， 表明該蛋白具有良好的免疫原性。用其制備了6株單克隆抗體，單抗的 類型均為IgGI。另外，非融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET23(a)/GDH在大腸桿菌 中表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶性形式存在，分子量約為52kDa，表達(dá)量約占菌 體蛋白的15%，經(jīng)過(guò)陰離子和陽(yáng)離子交換層析純化后，GDH純度達(dá)90%以 上。用該蛋白制備的鼠免疫學(xué)清與惡性瘧血樣進(jìn)行w匕stem一blot分析，發(fā) 現(xiàn)該蛋白具有良好的抗原性。用純化的GDH免疫小鼠制備了3株單克隆 抗體，其中2株為IgGZa，1株為IgGI。這些抗體的親和力常數(shù)介于lx10一” M一2.82x10一10 M. 利用所制備的9株單抗，進(jìn)行了膠體金標(biāo)記并建立了膠體金免疫層 析法，配對(duì)篩選出最佳診斷惡性瘧原蟲(chóng)的組合。發(fā)現(xiàn)以2B9單抗為包被 抗體，而以3C3單抗為金標(biāo)的抗體，其敏感性和特異性最好。以鏡檢法 為參照，其敏感性為86.66%，特異性為96.43%。 以上結(jié)果表明，我們?cè)趪?guó)內(nèi)首次制備了抗惡性瘧原蟲(chóng)GDH的單克隆 抗體，利用篩選的單抗建立的膠體金免疫層析法，能有效的檢測(cè)惡性瘧 原蟲(chóng)血樣，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化的惡性瘧原蟲(chóng)免疫診斷商品試劑盒打下 了基礎(chǔ)。下一步我們還將利用惡性瘧與間日瘧的同源性，希望能在制備 抗惡性瘧GDH的單克隆抗體制備中能篩選出同時(shí)抗惡性瘧原蟲(chóng)和間日 瘧原蟲(chóng)的單抗，并具有高的敏感性和特異性。
【圖文】：

光密度掃描表明其占菌體總蛋白25%以上，所制備包涵體純度可達(dá)70%以上(見(jiàn)圖1一1)。圖1一1.包涵體及純化的SDS一PAGE分析1.誘導(dǎo)前GDH/GsT:2.誘導(dǎo)后GDH/GST;3.破菌后上清;4~6.通過(guò)不同方法洗滌的包涵體;7.純化的GDH/GST;8.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Fig.1一1SDS一PAGEanalysisofinelusionbody1.GDH/GSTbeforeinduetion:2.GDH/GSTafterinduetion:3.supernatantaftersonieation:4~6.inelusionbodyafterwashingbydifferentmethods:7.purifiedGDH/GST:8.marker二、復(fù)性(一)稀釋復(fù)性在稀釋復(fù)性中，采用濁度測(cè)定和非還原SDS一PAGE監(jiān)控復(fù)性過(guò)程，結(jié)果表明，GDH/GST在A緩沖液復(fù)性效率最高(見(jiàn)表1一1)。

結(jié)果表明經(jīng)離子交換層析純化的GDH/GST重組蛋白，與免疫小鼠的抗血清在分子量66KDa處有明顯的反應(yīng)帶，而與正常小鼠血清則無(wú)反應(yīng)帶(見(jiàn)圖1一2)。123州kD)97，4隴，243，031，公20‘114.4圖1一2.純化的GDH/GST融合蛋白的Western一blot分析1.正常小鼠血清;2.抗GDH小鼠血清:3.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Fig.l一2.IdenfitieationofWestern一blotofpurifiedGDH/GSTfusionprotein1.normalmouseserum:2.mouseser皿againtGDH:3.m
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2638580