【摘要】：膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)對多巴胺能神經(jīng)元、運(yùn)動神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元和腸道神經(jīng)元等多種神經(jīng)元具有促進(jìn)存活及保護(hù)作用；促進(jìn)腎臟的發(fā)育和精原細(xì)胞的成熟。因此，其極有希望被用于治療神經(jīng)損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變等疾病。GDNF的神經(jīng)營養(yǎng)作用主要是通過兩類受體亞基介導(dǎo)，即膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體alpha(GFRαs)亞基和受體酪氨酸激酶RET亞基。GFRαs亞基是靠其C-末端的磷酯酰肌醇鍵(GPI)錨定在細(xì)胞膜外表面的膜外蛋白，它不能直接轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，GDNF首先與GFRα1結(jié)合形成GDNF-GFRα1復(fù)合物，此復(fù)合物再與RET結(jié)合形成三聚體復(fù)合物，并引起RET的二聚化和酪氨酸殘基自磷酸化，從而引起下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。后來的研究發(fā)現(xiàn)，在某些細(xì)胞上，不需GDNF刺激，GFRα1與RET即有弱結(jié)合。RET可增強(qiáng)GDNF與GFRα1的親和力。關(guān)于GDNF分子中與GFRα1結(jié)合并產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的位點(diǎn)目前已研究得比較清楚。但關(guān)于GFRα1分子的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系目前尚未見報道。如果能闡明GFRα1分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，可以深入認(rèn)識GDNF神經(jīng)營養(yǎng)作用的分子機(jī)制，為設(shè)計具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的小分子多肽提供靶標(biāo)；也可以促進(jìn)GDNF治療帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的研究進(jìn)程。 腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)是被廣泛用于研究神經(jīng)營養(yǎng)因子作用的細(xì)胞模型。不同的神經(jīng)營養(yǎng)因子可引起PC12細(xì)胞增值或分化的不同表型變化。PC12細(xì)胞不表達(dá)GDNF受體alphal(GFRα1)，而只表達(dá)低水平的RET。 本研究采用RT-PCR、重組DNA技術(shù)，構(gòu)建大鼠GFRα1表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中實現(xiàn)大鼠GFRα1的高效表達(dá)，并通過金屬螯和層析技術(shù)純化重組蛋白。然后，通過進(jìn)化蹤跡分析、同源序列聯(lián)配及計算機(jī)軟件模擬GFRα1的二級結(jié)構(gòu)，計算氨基酸殘基的保守性、親疏水性和溶劑可及面積，選定缺失突變的區(qū)域。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，，構(gòu)建了PC12-GFRα1、PC12-RET、PC12-GFRα1-RET和PC12-GFRα1Mn-RET(Mn：GFRα1各突變體)等一系列的基因工程細(xì)胞株。通過觀察GDNF對PC12各突變體基因工程細(xì)胞株存活和分化影響并結(jié)合Western-blot檢測結(jié)果，確定GFRα1中與GDNF結(jié)合并產(chǎn)生生物學(xué)功能的重要功能區(qū)域。本研究主要結(jié)果如下： 中文摘要 1.GFRal基因的克隆、表達(dá)及活性蛋白的獲得 從新生4d SD大鼠海馬組織中提取總RNA，通過RT一PCR，擴(kuò)增出GFRal cDNA。將GFRal CDNA克隆至含T7啟動子的質(zhì)粒pET一28a(+)中，構(gòu)建表 達(dá)質(zhì)粒pET一GFRal，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得表達(dá)菌株BLGFRal。表 達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS一PAGE檢測GFRal蛋白表達(dá)，并形成包涵體一。用 Ni2+一NTA樹脂純化并在Ni2+一柱上復(fù)性后，純度達(dá)90寫以上。 2.GDNF的表達(dá)及其對PC12基因工程細(xì)胞的影響 將表達(dá)質(zhì)粒pET一GDNF轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLZI(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在 M2+一NTA柱上進(jìn)行純化，稀釋復(fù)性后，純度達(dá)90%以上。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)， 把peDNA3.0一GFRal、peDNA3.0一RET及peDNA3.0一GFRal+peDNA3.0- RET質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入PclZ細(xì)胞，G418篩選穩(wěn)定克隆，構(gòu)建Pc12工程細(xì)脈株。 用GDNF分別刺激工程細(xì)胞，3天后觀察其存活和分化情況。純化和復(fù)性后的 重組GDNF蛋白，可顯著增強(qiáng)PC12一GFRal一RET工程細(xì)胞的存活和分化;對 PC12一RET工程細(xì)胞沒有任何作用;對PC12一GFRd的存活和分化作用顯著強(qiáng) 于對PC12--RET的作用，但也顯著低于對PC12一GFRal一RET細(xì)胞的作用，初 步明確GDNF對PC12細(xì)胞的營養(yǎng)作用必須經(jīng)GFRal介導(dǎo)并有RET參與。 3.GDNF家族及其受體GFRas家族的進(jìn)化蹤跡 用進(jìn)化蹤跡分析方法，對GDNF家族及其受體GFR家族進(jìn)行進(jìn)化分析; 利用ClustalX一Vl.81構(gòu)建該家族的多重序列聯(lián)配和進(jìn)化樹;利用PHD預(yù)測 GFRas的二級結(jié)構(gòu)及其殘基的溶劑可及性，從而繪出T GFRas二級結(jié)構(gòu)模式 圖，并進(jìn)一步確定突變區(qū)域和突變位點(diǎn)。 4.GFRal結(jié)構(gòu)與功能分析 利用PCR和DNA重組技術(shù)，在GFRQs二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的墓礎(chǔ)上，對G到Ral 分別進(jìn)行了N一端、G端、C一端螺旋和中央?yún)^(qū)的缺失突變。在大腸桿菌中分別表 達(dá)這四個突變體。利用PC12細(xì)胞的存活和分化情況，分別觀察這四個突變體 對介導(dǎo)GDNF神經(jīng)營養(yǎng)作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFRa1N一端對介導(dǎo)GDN護(hù)的 曹養(yǎng)作用不重要;C一端靠近中央?yún)^(qū)的螺旋對介導(dǎo)GDNF的營養(yǎng)作用則是必需 的;中央?yún)^(qū)對介導(dǎo)GDNF的神經(jīng)營養(yǎng)作用非常重要。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R346

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本文編號：2635997