【摘要】：目的：建立鼠疫耶爾森氏菌防污染多重PCR—微孔板雜交—EIA檢測(cè)鑒定技術(shù)用于鼠疫耶爾森氏菌的快速檢測(cè)鑒定。 方法：針對(duì)分別存在于鼠疫耶爾森氏菌pMT1和pPCP1質(zhì)粒上的毒力基因caf1和pla，以及一段276bp染色體序列3a分別設(shè)計(jì)引物，其中上游引物5’-末端生物素標(biāo)記，建立多重PCR反應(yīng)體系。用特別設(shè)計(jì)的三對(duì)引物制備捕獲探針并分別包被聚乙烯微孔板，原則是探針的長度在400—700bp之間，且包含靶序列，以提高雜交檢測(cè)效率。待鑒定標(biāo)本用生物素化的三對(duì)檢測(cè)引物多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系中用UNG防止產(chǎn)物污染。同時(shí)檢測(cè)caf1、3a和pla三個(gè)靶序列，相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為171、276和480bp。擴(kuò)增產(chǎn)物熱變性后在預(yù)包被捕獲探針的微孔板中嚴(yán)格條件下分別雜交和漂洗。信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)采用鏈霉親和素化的辣根過氧化物酶，以TMB作為底物，，顯色反應(yīng)結(jié)束后，2M H_2SO_4中止反應(yīng)，在Hyperion Micro4酶標(biāo)儀上讀取OD450，陽陰OD比值≥2.1為陽性。 結(jié)果：應(yīng)用該鑒定技術(shù)對(duì)我國鼠疫耶爾森氏菌17個(gè)生態(tài)型及新發(fā)現(xiàn)的青藏高原青海田鼠疫源地菌株的檢測(cè)結(jié)果表明，多重PCR-電泳法檢測(cè)結(jié)果，54株實(shí)驗(yàn)菌株均擴(kuò)增出預(yù)期的3條產(chǎn)物帶，相關(guān)菌株均陰性，檢測(cè)靈敏度為100fgDNA；多重PCR-微孔板雜交檢測(cè)結(jié)果，20株實(shí)驗(yàn)菌株全部陽性(OD450 0.151-0.967)，相關(guān)菌株均陰性(OD450 0.007-0.019)。其檢測(cè)靈敏度為10fg DNA。 結(jié)論：該方法用于鼠疫耶爾森氏菌的鑒定簡(jiǎn)便、快捷，具有很高的特異性和敏感性，多重PCR-微孔板雜交檢測(cè)的敏感性較多重PCR-電泳法檢測(cè)的敏感性高10倍；所研制的防污染多重PCR—微孔板雜交—EIA試劑克服了目前PCR試劑運(yùn)輸不便，產(chǎn)物污染所致假陽性和判定結(jié)果欠客觀的缺點(diǎn)，為鼠疫耶爾森氏菌的快速鑒定提供了有力手段。
【圖文】：

用3a引物對(duì)我國17個(gè)生態(tài)型及1個(gè)待定的生態(tài)型共計(jì)275株鼠疫耶爾森氏菌PCR鑒定結(jié)果均呈單一的擴(kuò)增帶，與標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量相比，其大小與預(yù)期設(shè)計(jì)的276bp一致(圖3a，3b，3c)。對(duì)假結(jié)核耶爾森氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌等近緣及相關(guān)菌株進(jìn)行檢測(cè)均陰性。表明該引物用于鼠疫耶爾森氏菌檢測(cè)具有很高的特異性。圖3a17個(gè)生態(tài)型及1個(gè)待定的生態(tài)型鼠疫耶爾森氏菌PCR電泳結(jié)果1一96實(shí)驗(yàn)菌株(表3中前%個(gè)樣本)鑒定全部陽性。中間產(chǎn)物帶為陽性對(duì)照(276bP)。FIG3aAgarosegeleleetroPhoresisPattemsshowingPCRamPlifieationProductsfrom96differentYPestisstains.Lane1to96XPesrisstrainsPCRamPlieons(rePresentativeoftheformer96strainsofTable.1:The276bPProduetshowsinthemiddleLanewasPositiveeontrol.

圖3bl7個(gè)生態(tài)型及1個(gè)待定的生態(tài)型鼠疫耶爾森氏菌PCR電泳結(jié)果96實(shí)驗(yàn)菌株(表3中間%個(gè)樣本)鑒定全部陽性。中間產(chǎn)物帶為陽性對(duì)照(276bp)和分子量Marker(100，300，500，700)FIG3bAgarosegeleleetroPhoresisPattemsshowingPCRamPlifieationProduetsfrom96differentYPestisstains.Lane1to96YPestisstrainsPCRamPlieons(RePresentativeofthemiddle96strainsofTable.l):TheProduetsshowinthemiddleLaneWaS276bPPositiveeontrolandDNAmoleeularsizemarker(100一bPladder)SeParately.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R378


本文編號(hào)：2632039