【摘要】：[背景] 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子(VEGI)是1997年Tan等率先通過篩選人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫發(fā)現(xiàn)的，因?qū)儆赥NF超家族成員，當(dāng)時(shí)命名為TL1(TNF-like ligand 1)。后因研究發(fā)現(xiàn)，VEGI_(174)的胞外區(qū)具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，因此大多稱之為VEGI。Chew等發(fā)現(xiàn)，VEGI全長基因?yàn)?7Kb，由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。按不同的拼接方式拼接產(chǎn)生三種mRNA，分別編碼由251、192、174個(gè)氨基酸殘基組成的VEGI_(251)、VEGI_(192)和VEGI_(174)異構(gòu)體。三者均含有Ⅳb外顯子，其中VEGI_(251)和VEGI_(174)的C末端有151個(gè)氨基酸相同。目前，國內(nèi)外對(duì)Ⅳb外顯子編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究較多。Zhai等研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染由IL-2的28個(gè)氨基酸殘基組成分泌信號(hào)肽和可能的VEGI_(174)的胞外區(qū)構(gòu)成的融合蛋白基因(sVEGI_(174))轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后能有效抑制腫瘤的生長，而將包括跨膜區(qū)的全長VEGI_(174)基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中不能有效抑制腫瘤的生長，說明只有VEGI_(174)的胞外區(qū)具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長的作用。 VEGI_(251)是由全長基因、4個(gè)開放讀碼框架編碼的蛋白質(zhì)，屬TNF超家族成員，與TNF家族其他成員的氨基酸同源性最大為24.6％。與其他TNF超家族相同，VEGI_(251)為Ⅱ型跨膜蛋白，胞漿外C末端179個(gè)氨基酸殘基組成其可溶性分子，組成其活性部分。生物活性的研究發(fā)現(xiàn)，VEGI_(251)是DR3和TR6／DcR3的TNF樣配體，能誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)紅白血病細(xì)胞的凋亡等；而sVEGI_(174)具有誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，激活JNK與P38MAPK等生物學(xué)活性，而且可以抑制新生血管生成從而抑制腫瘤的生長。盡管他們C末端結(jié)構(gòu)相同，但其生物活性有較大的不同。本課題在我室對(duì)sVEGI_(174)的結(jié)構(gòu)與功能及作用機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，克隆、表達(dá)了可溶性VEGI_(72-251)，并對(duì)其功能進(jìn)行了研究。 [目的] (1) 從人臍靜脈細(xì)胞中克隆VEGI_(251) cDNA的可溶性胞外區(qū)編碼基因VEGI_(72-251)，長度為540bp； 5第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 (2)將VEGI72.25，基因在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純 化; (3)研究可溶性VEG玩一251的生物學(xué)活性及其可能的作用機(jī)制: (4)可溶性vEGI72.2sl和s泥01:74的活性比較，分析可能的機(jī)制。 〔方法〕 (l)本研究用RT一PCR方法，從人臍靜脈細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增可溶性VEG1251 胞外區(qū)(即VEGI72一1)的。DNA序列，用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，膠回收 目的基因片段，連接到pMD18一克隆載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHSQ，PCR和酶切 篩選陽性克隆，全自動(dòng)DNA測序驗(yàn)證序列[2’]; (2)vEGI72一251亞克隆到nBV220表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHSQ，酶切鑒 定，陽性克隆用42℃熱誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用SDS一PAGE分析和westem blot驗(yàn) 證; (3)重組蛋白質(zhì)的純化; (4)偶氮顯色法檢測樣品的內(nèi)毒素含量; (5)用體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行活性檢測122]，酶標(biāo)儀測OD值; (6)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成影響的檢測123]; (7)用ELISA法檢測VEGI作用pBMC24h后培養(yǎng)上清中IL一2和IFN，的含 量; (8)建立了C57小鼠種植B16細(xì)胞的腫瘤模型，采用此模型研究可溶性 VEGI25;對(duì)腫瘤生長的影響; (9)可溶性VEGI72_25;和sVEGI:7;的活性比較，分析可能的機(jī)制。 〔結(jié)果〕 (1)成功地從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中克隆了可溶性VEGI251胞外區(qū)VEG玩一251 的基因，測序結(jié)果與文獻(xiàn)一致; (2)可溶性VEGI251胞外區(qū)蛋白在大腸桿菌DHSQ中獲得高效表達(dá)。SDS- PAGE分析表明，，蛋白質(zhì)主要以包涵體形式存在于細(xì)菌中，經(jīng)洗滌、溶解、復(fù)性、 DEAE陰離子交換柱和SephacryS一200層析柱純化后蛋白質(zhì)純度約為94.5%。測 6第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 定分子量約為20kDa，與預(yù)期大小一致。偶氮顯色法檢測樣品的內(nèi)毒素含量為 80EU/mg。Westem blot結(jié)果表明，該蛋白能與兔抗人sVEGll7;多克隆抗體特異性 結(jié)合。細(xì)胞活性檢測結(jié)果表明，可溶性vEGI25;胞外區(qū)蛋白在(0~80p留ml)濃 度范圍內(nèi)對(duì)HUVEC、ECV3O4、Molt一4、B16等細(xì)胞的形態(tài)無明顯影響，MTT法檢測 細(xì)胞數(shù)量無明顯改變。ELISA檢測結(jié)果表明，可溶性VEG玩一51能刺激PBMC細(xì)胞 的工L一2和IF林分泌增多。C57小鼠種植B16細(xì)胞的腫瘤模型的研究表明，可溶 性VEGI72一25;不能抑制B16細(xì)胞在C57小鼠的生長。 〔結(jié)論〕 (1) vEGI72_25，胞外區(qū)在大腸桿菌中以包涵體的形式獲得較高的表達(dá)，達(dá)菌 體總蛋白的25.6%; (2)VEGI72一251胞外區(qū)蛋白質(zhì)經(jīng)純化后，純度達(dá)到94.5%。經(jīng)復(fù)性后具有明 顯的生物學(xué)活性，可刺激T細(xì)胞IL一2和IFN丫分泌增多; (3)VEGI72一25一與sVEGI一科的生物學(xué)活性不同:雖然VEGI72一251胞外區(qū)C 末端的約146個(gè)氨基酸與sVEGll7;相同，但VEG玩一251不能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的和雞 胚絨毛尿囊膜的血管生成，而sVEGll74則不能激PBMC細(xì)胞工L一2分泌增多。蛋 白質(zhì)的氨基酸數(shù)量和增加或減少序列變化會(huì)改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，從而影響蛋 白質(zhì)與相應(yīng)配、受體的結(jié)合，改變蛋白質(zhì)的功能l2’一26]。推測vEGI72_25，與T細(xì)胞 受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)位于其N端，N端增加的29個(gè)氨基酸殘基具有與T細(xì)胞結(jié)合的 結(jié)構(gòu);而N端增加的氨基?
【圖文】：

2一25:基因?qū)EGI72-251和VEGll。l一51的RT一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，結(jié)果見圖1一2:M2卜VEGI一01一2引圖l一2人VEGllol二s，和VEGI72一251基因的RT一PCR擴(kuò)增「19.1一2嚇pCRampli月eationofhumanVEGllol一251andVEGI72一251.

39第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文500bP-刁卜~VEGI路”:圖1一VEGI72一51的序列拼接瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1一4SPlieinggeneofVEGI7之一251M:DL2000DNAMar晚乓1:sPlieinggeneofVEGI左一252結(jié)果表明，序列拼接出的基因大小與預(yù)測的大小一致。將目的基因條帶切下，進(jìn)行膠回收，置一20℃冰箱保存。2.2鑒定人VEG玩一251基因以回收的VEG玩一25，基因條帶與pMD18一T載體連接，將pMD18一T一vEGI72-251質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DH5a后，用酶切法鑒定陽性菌，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢查，結(jié)果見圖l一5。M123456‘00h一書一VEGI72.25-圖l一5重組pMD一1ST一vEGI72一251質(zhì)粒的酶切鑒定Fig
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 付生法,陸應(yīng)麟,張朝山,陳坤;檢測血管生長因子作用的雞胚絨毛尿囊膜技術(shù)[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;1993年04期

本文編號(hào)：2624741