【摘要】：端粒酶維持線形染色體的端粒末端結(jié)構(gòu)的完整，防止染色體的縮短及和其它染色體的融合。有資料表明超過85％的腫瘤細(xì)胞表達(dá)端粒酶活性，而在正常組織中很少表達(dá)。人類端粒酶主要包括3種成分：人端粒酶RNA成分(hTR)，人端粒酶相關(guān)蛋白(hTP1)，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)。hTERT mRNA的表達(dá)水平與端粒酶活性正相關(guān)，hTERT只在端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞和永生化細(xì)胞中表達(dá)，正常組織中不表達(dá)。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)了來源于hTERT的多肽可由MHC Ⅰ類分子加工遞呈，作為抗原激發(fā)腫瘤特異性CTL反應(yīng)，可殺死不同組織來源的腫瘤細(xì)胞。hTERT是一種可表達(dá)于多種腫瘤組織中的腫瘤相關(guān)抗原，編碼hTERT的基因是有很好應(yīng)用前景的腫瘤免疫治療的靶基因。 目的： 本課題擬構(gòu)建hTERT基因真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hTERT及原核重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-hTERT，并觀察在BL21細(xì)菌中原核重組質(zhì)粒的表達(dá)，為進(jìn)一步探討以hTERT為靶點(diǎn)的腫瘤基因免疫治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 一．重組質(zhì)粒的構(gòu)建及基因測序 1．真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hTERT的構(gòu)建：從腫瘤組織中提取總RNA；用RT-PCR方法擴(kuò)增出帶有Hind Ⅲ，BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)的hTERT基因片段；hTERT基因片段與pGEM-T Easy克隆載體連接，將重組子轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)大腸桿菌中，用藍(lán)白篩選，PCR擴(kuò)增，PvuⅡ酶切鑒定等方法篩選出陽性克隆。用Hind Ⅲ及BamH Ⅰ酶切pGEM-T Easy-hTERT質(zhì)粒獲得目的片段，與Hind Ⅲ及BamH Ⅰ酶切處理過的pcDNA3.1載體連接，重組子轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)大腸桿菌中，用PCR擴(kuò)增，PvuⅡ酶切鑒定等方法篩選出 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 hTERT重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá) 陽性克隆并測序。2.原核重組質(zhì)粒pGEX一4T-1一hTERT的構(gòu)建:用Rl’- pCR方法擴(kuò) 增出帶有EooRI酶切位點(diǎn)的hTERT基因片段，hTERT基因片段與pGEM一T Easy 克隆載體連接，將重組子轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)大腸桿菌中，用藍(lán)白篩選，PCR 擴(kuò)增，Pvun酶切鑒定等方法篩選出陽性克隆。用EcoRI酶切pGEM一T Easy一hTERT質(zhì)粒得到目的片段與用EcoRI酶切過的pGEX一4T-1質(zhì)粒連接，重 組子轉(zhuǎn)化BLZI感受態(tài)細(xì)菌，PCR擴(kuò)增篩選出陽性克隆�；驕y序并用Omiga 2.0 軟件比較分析重組質(zhì)粒中hTERT基因片段與GenBank中公布的已知序列的同源 性。 二.原核重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)鑒定IPTG誘導(dǎo)帶有pGEX一4T-1一hTERT質(zhì)粒 的BL21細(xì)菌融合蛋白的表達(dá)，取不同時(shí)間的培養(yǎng)物進(jìn)行SDS一PAGE電泳分析， 并進(jìn)行薄層凝膠光密度掃描測定目的蛋白表達(dá)量，同時(shí)對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行 Westem一blot檢測。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建了PcDNA3.1一hTERT真核重組質(zhì)粒及pGEx一4T-1一hTERT原核 重組質(zhì)粒。 2.經(jīng)過測序表明，hTERT基因片段全長951帥，編碼由317個(gè)氨基酸殘基 組成、相對分子量為37KDa的蛋白質(zhì)。hTERT基因與GenB歇正公布的相應(yīng)基因 進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明核普酸序列的同源性為98‘73%，其編碼產(chǎn)物的氨基 酸序列的同源性為99.68%。 3.對sDS一PAGE結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，含pGEx一 4T-1一hTERT質(zhì)粒的BLZI細(xì)菌能 夠表達(dá)出63KDa的融合蛋白。薄層凝膠光密度掃描測定其表達(dá)水平最高為 28.4%，以IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)表達(dá)量最高。 4.認(rèn)七stom一blot檢測表明該融合蛋白可被hTERI，多抗識別。 結(jié)論: 1，序列分析結(jié)果證明了所選取的hTERT基因片段是保守區(qū)域，為以hTERT 為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療研究提供重要的前提。 2.成功構(gòu)建了peDNA3 .1一hTERT真核重組質(zhì)粒和pGEX一4T-1一hTERT原核 重組質(zhì)粒。 3.誘導(dǎo)pGEx一4T-1一hTERT重組質(zhì)粒，獲得分子量為63KDa的GsT-hTERT 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 hTERT重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá) 融合蛋白。用抗hTERT多抗對融合蛋白進(jìn)行W七stem blot鑒定，，有明顯的抗原抗 體反應(yīng)，證實(shí)融合蛋白中含有hTERT目的基因片段表達(dá)的相應(yīng)抗原蛋白。 4.PcDNA3.1一hTERT真核重組質(zhì)粒及pGEX一4T-1一hTERT原核重組質(zhì)粒的成 功構(gòu)建，為進(jìn)一步探討以hTERT為靶點(diǎn)的腫瘤免疫基因治療研究提供了重要的 實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

士學(xué)位論文hTERT重組質(zhì)圖1pG陰seTEasy質(zhì)粒(克隆載體)圖譜M一TEasy是為方便PCR產(chǎn)物克隆、藍(lán)白篩選重組體、體外轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)的載體。它由以下部分組成:絲狀噬菌體復(fù)制起始con內(nèi)單鏈DNA的合成;質(zhì)粒在E.coli中的復(fù)制起始點(diǎn)(o(靦pr)用于原核細(xì)胞篩選;多克隆位點(diǎn);多克隆位點(diǎn)兩側(cè)錄起始點(diǎn)，使插入的外源DNA每一條鏈都能在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)突出的T堿基，這一特點(diǎn)使載體和產(chǎn)物之間產(chǎn)生小的互補(bǔ)效果。

圖3pGE卜4T一1原核表達(dá)載體圖EX一4T一1原核表達(dá)載體:具有tac啟動(dòng)子;lac操縱基因;lac工膚昔膚琉基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因;原核細(xì)胞選擇標(biāo)志采用內(nèi)酞胺因(Ampr)。ED、丙烯酞胺、N’N一亞甲基雙丙烯酞胺;p一琉基乙醇(Sigm50(上海政翔化學(xué)試劑研究所);二氨聯(lián)苯胺(DAB)(Roche公困C膜X北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司);PVDFWeste(Bio一Rad公司);proteinmarker(TaKaRa公司)。(鼠抗hTERT多抗血清)，二抗(HRI，標(biāo)記的兔抗鼠IgG)。和常用溶液的配制一
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 張巧,趙國強(qiáng),劉紅梅,宮亞歐,丁蘭萍,薛樂勛,楊勝利;人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年03期

2 鐘飛;李輝;周衛(wèi)華;;黃芪甲甙對大鼠阿霉素心肌細(xì)胞凋亡的影響[J];吉首大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2008年06期

3 梅凌;胡亞哲;扈盛;;心肌細(xì)胞復(fù)制與心臟端粒酶活化因素[J];武漢體育學(xué)院學(xué)報(bào);2007年02期

4 梁錚錚,胡劍;端粒(酶)的結(jié)構(gòu)功能及其與衰老和癌癥的關(guān)系[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2003年01期

5 艾敏;楊勝利;姜愛華;;融合基因pEGFP-C3-B7.2-hTERT誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答及抑制肝癌移植瘤[J];中國腫瘤生物治療雜志;2008年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前6條

1 王瑋;PLGA/纖維蛋白凝膠復(fù)合支架的制備及其用于軟骨再生的研究[D];浙江大學(xué);2010年

2 韓燁;不同毒力的MDV引起的端粒酶活性變化及MDV特異序列在宿主細(xì)胞的定位研究[D];吉林大學(xué);2005年

3 唐峰;hTERTmRNA表達(dá)用于乳腺癌鑒別診斷及與TP53和c-Myc相關(guān)性研究[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

4 鄒亞學(xué);5’調(diào)控序列的甲基化水平及siRNA對端粒酶活性的影響[D];吉林大學(xué);2007年

5 李玲;順反異構(gòu)酶Pin1調(diào)控食管鱗癌發(fā)病的分子機(jī)制[D];鄭州大學(xué);2010年

6 李丹;PLGA/羥基磷灰石復(fù)合支架的制備及其用于骨修復(fù)的研究[D];浙江大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前7條

1 馬一君;A型流感病毒核蛋白基因的克隆與表達(dá)[D];鄭州大學(xué);2005年

2 秦冰;三種細(xì)胞系中DNA聚合酶β基因片段的克隆及序列分析[D];鄭州大學(xué);2005年

3 孟玲;耐輻射奇球菌超氧化物歧化酶基因的克隆與表達(dá)[D];四川大學(xué);2005年

4 張世杰;HBsAg和B19 VP2復(fù)合抗原的基因克隆及表達(dá)[D];鄭州大學(xué);2006年

5 丁力;幽門螺桿菌CagA基因克隆及表達(dá)[D];鄭州大學(xué);2005年

6 梅凌;長期不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對大鼠心肌細(xì)胞端粒酶表達(dá)的影響及意義[D];武漢體育學(xué)院;2007年

7 高文娟;多肽Epithalon的合成及其對人胎肝細(xì)胞L-02端粒酶和端粒的作用研究[D];重慶大學(xué);2007年

本文編號：2623616