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hTERT重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá)

發(fā)布時(shí)間:2020-04-11 12:52
【摘要】:端粒酶維持線形染色體的端粒末端結(jié)構(gòu)的完整,防止染色體的縮短及和其它染色體的融合。有資料表明超過85%的腫瘤細(xì)胞表達(dá)端粒酶活性,而在正常組織中很少表達(dá)。人類端粒酶主要包括3種成分:人端粒酶RNA成分(hTR),人端粒酶相關(guān)蛋白(hTP1),人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)。hTERT mRNA的表達(dá)水平與端粒酶活性正相關(guān),hTERT只在端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞和永生化細(xì)胞中表達(dá),正常組織中不表達(dá)。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)了來源于hTERT的多肽可由MHC Ⅰ類分子加工遞呈,作為抗原激發(fā)腫瘤特異性CTL反應(yīng),可殺死不同組織來源的腫瘤細(xì)胞。hTERT是一種可表達(dá)于多種腫瘤組織中的腫瘤相關(guān)抗原,編碼hTERT的基因是有很好應(yīng)用前景的腫瘤免疫治療的靶基因。 目的: 本課題擬構(gòu)建hTERT基因真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hTERT及原核重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-hTERT,并觀察在BL21細(xì)菌中原核重組質(zhì)粒的表達(dá),為進(jìn)一步探討以hTERT為靶點(diǎn)的腫瘤基因免疫治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法: 一.重組質(zhì)粒的構(gòu)建及基因測序 1.真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hTERT的構(gòu)建:從腫瘤組織中提取總RNA;用RT-PCR方法擴(kuò)增出帶有Hind Ⅲ,BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)的hTERT基因片段;hTERT基因片段與pGEM-T Easy克隆載體連接,將重組子轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)大腸桿菌中,用藍(lán)白篩選,PCR擴(kuò)增,PvuⅡ酶切鑒定等方法篩選出陽性克隆。用Hind Ⅲ及BamH Ⅰ酶切pGEM-T Easy-hTERT質(zhì)粒獲得目的片段,與Hind Ⅲ及BamH Ⅰ酶切處理過的pcDNA3.1載體連接,重組子轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)大腸桿菌中,用PCR擴(kuò)增,PvuⅡ酶切鑒定等方法篩選出 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 hTERT重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá) 陽性克隆并測序。2.原核重組質(zhì)粒pGEX一4T-1一hTERT的構(gòu)建:用Rl’- pCR方法擴(kuò) 增出帶有EooRI酶切位點(diǎn)的hTERT基因片段,hTERT基因片段與pGEM一T Easy 克隆載體連接,將重組子轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)大腸桿菌中,用藍(lán)白篩選,PCR 擴(kuò)增,Pvun酶切鑒定等方法篩選出陽性克隆。用EcoRI酶切pGEM一T Easy一hTERT質(zhì)粒得到目的片段與用EcoRI酶切過的pGEX一4T-1質(zhì)粒連接,重 組子轉(zhuǎn)化BLZI感受態(tài)細(xì)菌,PCR擴(kuò)增篩選出陽性克隆;驕y序并用Omiga 2.0 軟件比較分析重組質(zhì)粒中hTERT基因片段與GenBank中公布的已知序列的同源 性。 二.原核重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)鑒定IPTG誘導(dǎo)帶有pGEX一4T-1一hTERT質(zhì)粒 的BL21細(xì)菌融合蛋白的表達(dá),取不同時(shí)間的培養(yǎng)物進(jìn)行SDS一PAGE電泳分析, 并進(jìn)行薄層凝膠光密度掃描測定目的蛋白表達(dá)量,同時(shí)對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行 Westem一blot檢測。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建了PcDNA3.1一hTERT真核重組質(zhì)粒及pGEx一4T-1一hTERT原核 重組質(zhì)粒。 2.經(jīng)過測序表明,hTERT基因片段全長951帥,編碼由317個(gè)氨基酸殘基 組成、相對分子量為37KDa的蛋白質(zhì)。hTERT基因與GenB歇正公布的相應(yīng)基因 進(jìn)行同源性比較,結(jié)果表明核普酸序列的同源性為98‘73%,其編碼產(chǎn)物的氨基 酸序列的同源性為99.68%。 3.對sDS一PAGE結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),含pGEx一 4T-1一hTERT質(zhì)粒的BLZI細(xì)菌能 夠表達(dá)出63KDa的融合蛋白。薄層凝膠光密度掃描測定其表達(dá)水平最高為 28.4%,以IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)表達(dá)量最高。 4.認(rèn)七stom一blot檢測表明該融合蛋白可被hTERI,多抗識別。 結(jié)論: 1,序列分析結(jié)果證明了所選取的hTERT基因片段是保守區(qū)域,為以hTERT 為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療研究提供重要的前提。 2.成功構(gòu)建了peDNA3 .1一hTERT真核重組質(zhì)粒和pGEX一4T-1一hTERT原核 重組質(zhì)粒。 3.誘導(dǎo)pGEx一4T-1一hTERT重組質(zhì)粒,獲得分子量為63KDa的GsT-hTERT 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 hTERT重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá) 融合蛋白。用抗hTERT多抗對融合蛋白進(jìn)行W七stem blot鑒定,,有明顯的抗原抗 體反應(yīng),證實(shí)融合蛋白中含有hTERT目的基因片段表達(dá)的相應(yīng)抗原蛋白。 4.PcDNA3.1一hTERT真核重組質(zhì)粒及pGEX一4T-1一hTERT原核重組質(zhì)粒的成 功構(gòu)建,為進(jìn)一步探討以hTERT為靶點(diǎn)的腫瘤免疫基因治療研究提供了重要的 實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】:

表達(dá)載體


士學(xué)位論文hTERT重組質(zhì)圖1pG陰seTEasy質(zhì)粒(克隆載體)圖譜M一TEasy是為方便PCR產(chǎn)物克隆、藍(lán)白篩選重組體、體外轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)的載體。它由以下部分組成:絲狀噬菌體復(fù)制起始con內(nèi)單鏈DNA的合成;質(zhì)粒在E.coli中的復(fù)制起始點(diǎn)(o(靦pr)用于原核細(xì)胞篩選;多克隆位點(diǎn);多克隆位點(diǎn)兩側(cè)錄起始點(diǎn),使插入的外源DNA每一條鏈都能在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)突出的T堿基,這一特點(diǎn)使載體和產(chǎn)物之間產(chǎn)生小的互補(bǔ)效果。

丙烯,操縱基因,精細(xì)化學(xué)品,二氨


圖3pGE卜4T一1原核表達(dá)載體圖EX一4T一1原核表達(dá)載體:具有tac啟動(dòng)子;lac操縱基因;lac工膚昔膚琉基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因;原核細(xì)胞選擇標(biāo)志采用內(nèi)酞胺因(Ampr)。ED、丙烯酞胺、N’N一亞甲基雙丙烯酞胺;p一琉基乙醇(Sigm50(上海政翔化學(xué)試劑研究所);二氨聯(lián)苯胺(DAB)(Roche公困C膜X北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司);PVDFWeste(Bio一Rad公司);proteinmarker(TaKaRa公司)。(鼠抗hTERT多抗血清),二抗(HRI,標(biāo)記的兔抗鼠IgG)。和常用溶液的配制一
【學(xué)位授予單位】:鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2004
【分類號】:R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號:2623616

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