本文關(guān)鍵詞：IKKα參與調(diào)控UVB刺激作用下p53誘導(dǎo)活化的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景紫外線(Ultraviolet radiation,UV)是一種典型的的環(huán)境損傷因素;根據(jù)波長大小可分為UVA(320-400nm)、UVB(280-320nm)和UVC(200-280nm)三種類型。其中UVB是誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生損傷效應(yīng)的關(guān)鍵因素。UVB除了能夠誘導(dǎo)VEGF、TNFα等一系列炎性因子分泌和誘導(dǎo)表達(dá)并介導(dǎo)炎性損傷效應(yīng)外,還能夠通過誘導(dǎo)p53活化并介導(dǎo)DNA損傷效應(yīng)。我們的前期工作研究結(jié)果已經(jīng)揭示了UVB誘導(dǎo)炎性損傷效應(yīng)發(fā)生的分子機(jī)制,因此本論文著重討論UVB誘導(dǎo)p53活化并介導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)的分子機(jī)制。隨著IKK/NF-κB信號途徑研究的不斷深入,一些NF-κB和IκB非相關(guān)的新型IKK激酶底物分子被相繼發(fā)現(xiàn),提示負(fù)責(zé)啟動IKK/NF-k B信號通路誘導(dǎo)活化的關(guān)鍵上游信號分子IKK激酶具有誘導(dǎo)NF-κB途徑活化以外的新功能。IKKa作為IKK激酶的一個(gè)重要的催化亞基,它能夠通過激活一系列NF-κB非相關(guān)的信號蛋白分子并以NF-κB非依賴方式參與多種生物學(xué)反應(yīng)。本課題組長期從事IKKα不依賴于IKKβ和NF-κB的新功能機(jī)制研究,并在UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷反應(yīng)模型中取得了一些研究進(jìn)展。我們發(fā)現(xiàn):IKKa能夠不依賴于NF-κB調(diào)控UVB刺激作用下VEGF的誘導(dǎo)表達(dá),并且介導(dǎo)了炎性損傷效應(yīng)。目的探索IKK激酶催化亞基IKKa參與調(diào)控UVB誘導(dǎo)p53活化并介導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)的分子機(jī)制。方法采用雙熒光素酶報(bào)道基因分析系統(tǒng)檢測在UVB誘導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)中p53的轉(zhuǎn)錄激活活性;通過Western Blot檢測Hacat和MEFs細(xì)胞中p53ser15(人)/ser18(鼠)、ATR、ATM、CHK1、LKB1和PERK蛋白的表達(dá);免疫共沉淀檢測在生理狀態(tài)下內(nèi)源IKKα與ATR、ATM、CHK1、LKB1、PERK是否存在相互作用,通過流式細(xì)胞術(shù)探討了p53與IKKα對凋亡反應(yīng)的敏感性。結(jié)果1、我們發(fā)現(xiàn)UVB能夠通過誘導(dǎo)Hacat和MEFs細(xì)胞中p53活化而介導(dǎo)促細(xì)胞凋亡效應(yīng),同時(shí)我們確定了IKKα在p53的誘導(dǎo)活化及促細(xì)胞凋亡反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。2、IKKα能夠與經(jīng)典DNA損傷信號途徑ATR-ATM/CHK1之間發(fā)生功能聯(lián)絡(luò)并介導(dǎo)p53的誘導(dǎo)活化反應(yīng)。期間,IKKα與CHK1發(fā)生相互結(jié)合反應(yīng)是影響ATR-ATM/CHK1蛋白復(fù)合體形成的關(guān)鍵因素。IKKα基因缺失或功能障礙條件下,ATR和ATM無法結(jié)合CHK1,以上所有信號分子的誘導(dǎo)活化反應(yīng)被抑制,因此造成p53活化反應(yīng)受抑。3、IKKα也能夠與能量代謝應(yīng)激因子LKB1之間發(fā)生功能聯(lián)絡(luò)并介導(dǎo)p53的誘導(dǎo)活化反應(yīng)。IKKα的存在是影響LKB1與p53形成蛋白復(fù)合體的關(guān)鍵因素。IKKα基因缺失或功能障礙條件下,LKB1無法結(jié)合p53并導(dǎo)致p53活化反應(yīng)受抑。4、UVB能夠誘導(dǎo)Hacat和MEFs細(xì)胞中PERK活化,并且IKKα還能夠通過激活PERK介導(dǎo)p53的誘導(dǎo)活化反應(yīng)。IKKα也可結(jié)合于PERK/p53蛋白復(fù)合體;但I(xiàn)KKα的存在并是PERK與p53之間發(fā)生相互結(jié)合作用的前提條件。結(jié)論1、揭示了IKKα/ATR-ATM/CHK1/p53信號通路在介導(dǎo)UVB誘導(dǎo)細(xì)胞損傷反應(yīng)中的作用機(jī)制;2、LKB1是實(shí)現(xiàn)UVB刺激作用下IKKα調(diào)控p53誘導(dǎo)活化的另一關(guān)鍵信號傳遞分子;3、IKKα可以通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)p53活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：UVB IKKα p53 ATR CHK1 LKB1 PERK
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 縮略詞表11-12
• 引言12-16
• 第一部分 IKKα通過調(diào)控P53的誘導(dǎo)活化反應(yīng)介導(dǎo)UVB引發(fā)的促細(xì)胞凋亡效應(yīng)16-28
• 1 材料和試劑16-17
• 1.1 質(zhì)粒及siRNA16
• 1.2 細(xì)胞系16-17
• 1.3 細(xì)胞生物學(xué)試劑17
• 1.4 分子生物學(xué)試劑17
• 1.5 其他常規(guī)試劑配制方法參考<<分子克隆實(shí)驗(yàn)指南>>17
• 2 實(shí)驗(yàn)儀器17
• 3 實(shí)驗(yàn)方法17-19
• 3.1 雙熒光素酶報(bào)告基因分析17-18
• 3.2 免疫印跡（Western blot）分析18
• 3.3 PI染色與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合方法18-19
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-26
• 4.1 UVB誘導(dǎo)Hacat和MEFs細(xì)胞中p53活化并介導(dǎo)促細(xì)胞凋亡反應(yīng)19-21
• 4.2 IKKα 參與調(diào)控UVB刺激作用下Hacat和MEFs細(xì)胞反應(yīng)中p53的誘導(dǎo)活化反應(yīng)及促細(xì)胞凋亡效應(yīng)21-26
• 5 討論26-28
• 第二部分 IKKα通過激活A(yù)TR-ATM/CHK1途徑介導(dǎo)UVB誘導(dǎo)的P53磷酸化修飾反應(yīng)28-40
• 1 材料和試劑28-29
• 1.1 質(zhì)粒及siRNA28
• 1.2 細(xì)胞系28
• 1.3 細(xì)胞生物學(xué)試劑28-29
• 1.4 分子生物學(xué)試劑29
• 1.5 其他常規(guī)試劑配制方法參考<<分子克隆實(shí)驗(yàn)指南>>29
• 2 實(shí)驗(yàn)儀器29
• 3 實(shí)驗(yàn)方法29-30
• 3.1 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)29-30
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-39
• 4.1 UVB誘導(dǎo)Hacat和MEFs細(xì)胞中ATR、ATM、CHK1活化30
• 4.2 抑制ATR、ATM表達(dá)顯著下調(diào)CHK1及p53的誘導(dǎo)活化水平30-32
• 4.3 抑制CHK1表達(dá)顯著下調(diào)p53的誘導(dǎo)活化反應(yīng)32-33
• 4.4 ATR-ATM/CHK1/p53信號途徑中信號分子聚集體的形成33-34
• 4.5 IKKα調(diào)控ATR-ATM/CHK1/p53信號途徑活化34-36
• 4.6 IKKα結(jié)合于ATR-ATM/CHK1/p53聚集體是其發(fā)揮功能的必須條件36-39
• 5 討論39-40
• 第三部分 IKKα通過激活LKB1介導(dǎo)UVB誘導(dǎo)的P53磷酸化修飾反應(yīng)40-48
• 1 材料和試劑40-41
• 1.1 質(zhì)粒40
• 1.2 細(xì)胞系40
• 1.3 細(xì)胞生物學(xué)試劑40-41
• 1.4 分子生物學(xué)試劑41
• 1.5 其他常規(guī)試劑配制方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》41
• 2 實(shí)驗(yàn)儀器41
• 3 實(shí)驗(yàn)方法41
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-46
• 4.1 UVB誘導(dǎo)Hacat和MEFs細(xì)胞中LKB1的活化41
• 4.2 抑制LKB1活性顯著下調(diào)p53的誘導(dǎo)活化水平41-42
• 4.3 LKB1/p53信號途徑中信號分子聚集體的形成42-43
• 4.4 IKKα 調(diào)控LKB1/p53信號途徑活化43-45
• 4.5 IKKα 結(jié)合于LKB1/p53聚集體是其發(fā)揮功能的必須條件45-46
• 5 討論46-48
• 第四部分 IKKα通過激活PERK介導(dǎo)UVB誘導(dǎo)的P53磷酸化修飾反應(yīng)48-58
• 1 材料和試劑48-49
• 1.1 質(zhì)粒48
• 1.2 細(xì)胞系48
• 1.3 細(xì)胞生物學(xué)試劑48-49
• 1.4 分子生物學(xué)試劑49
• 1.5 其他常規(guī)試劑配制方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》49
• 2 實(shí)驗(yàn)儀器49
• 3 實(shí)驗(yàn)方法49
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-55
• 4.1 UVB誘導(dǎo)Hacat和MEFs細(xì)胞中PERK和p53的活化49-50
• 4.2 抑制PERK表達(dá)水平顯著下調(diào)p53的誘導(dǎo)活化反應(yīng)50-51
• 4.3 PERK/p53信號途徑中信號分子聚集體的形成51
• 4.4 IKKα調(diào)控PERK/p53信號途徑活化51-53
• 4.5 IKKα結(jié)合于PERK/p53聚集體是其發(fā)揮功能的必須條件53-55
• 5 討論55-58
• 全文總結(jié)58-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 綜述64-68
• 參考文獻(xiàn)66-68
• 致謝68-70
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄及參與基金項(xiàng)目70-71

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本文編號：262132