發(fā)布時(shí)間：2017-03-22 19:02

  本文關(guān)鍵詞：EPEC粘附相關(guān)分子抗血清制備及其中和能力探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:構(gòu)建EPEC粘附相關(guān)分子Bfp A、Esp A和Intimin C300(羧基端300個(gè)氨基酸)原核表達(dá)載體,純化相應(yīng)蛋白并制備其抗血清,并探討抗血清對(duì)EPEC粘附Hep-2細(xì)胞的影響。方法1.以EPEC標(biāo)準(zhǔn)株E2348/69全基因組為模板,設(shè)計(jì)引物,采用PCR擴(kuò)增bfp A、esp A和intimin C300目的基因,并克隆到T載體;經(jīng)雙酶切鑒定后,亞克隆至表達(dá)載體p ET32a,獲得重組表達(dá)質(zhì)粒p ET32a-bfp A、p ET32a-esp A和p ET32a-intimin C300;基因測(cè)序正確后轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL21(DE3),構(gòu)建工程菌BL21/p ET32a-bfp A、BL21/p ET32a-esp A和BL21/p ET32a-intimin C300。2.IPTG誘導(dǎo)工程菌BL21/p ET32a-bfp A、BL21/p ET32a-esp A和BL21/p ET32a-intimin C300表達(dá)目的蛋白,SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)表達(dá)結(jié)果。3.通過(guò)Ni-柱親和層析方法純化目的蛋白,用純化目的蛋白為抗原輔以佐劑免疫家兔,末次免疫1周后,用心臟采血的方式收集家兔血清,得到抗血清。對(duì)流免疫電泳檢測(cè)其效價(jià),玻片凝集檢測(cè)抗血清和EPEC特異結(jié)合的能力。4.用不同稀釋度的抗血清中和細(xì)菌,用未免疫的家兔血清做對(duì)照,顯微鏡觀察細(xì)菌的粘附情況,從而判斷抗血清對(duì)EPEC粘附Hep-2細(xì)胞的影響。結(jié)果1.成功構(gòu)建EPEC粘附相關(guān)分子Bfp A、Esp A和Intimin C300原核表達(dá)載體p ET32a-bfp A、p ET32a-esp A和p ET32a-intimin C300,并構(gòu)建了相應(yīng)的工程菌BL21/p ET32a-bfp A、BL21/p ET32a-esp A和BL21/p ET32aintimin C300,工程菌都主要以可溶性形式表達(dá)目的蛋白,SDS-PAGE和Western-blot顯示表達(dá)產(chǎn)物分子量分別約為42KD、41KD和54KD,與預(yù)期分子量相符。2.獲得純度較高的Esp A融合蛋白,但未能得到Bfp A和Intimin C300純化蛋白,其純化條件有待進(jìn)一步摸索。3.獲得Esp A抗血清,玻片凝集實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗血清能有效結(jié)合EPEC,對(duì)流免疫電泳檢測(cè)其效價(jià)僅為1:2,但中和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗血清在稀釋倍數(shù)16以?xún)?nèi)皆能有效抑制EPEC粘附Hep-2細(xì)胞。結(jié)論:建立了EPEC粘附相關(guān)蛋白Bfp A、Esp A和Intimin C300原核表達(dá)系統(tǒng),并通過(guò)Ni-柱親和層析法有效純化得到含有組氨酸標(biāo)簽的Esp A蛋白,用該蛋白免疫家兔,制備了相應(yīng)的抗血清,雖然抗血清的滴度較低,但抗血清可以有效中和EPEC對(duì)Hep-2細(xì)胞的粘附,因此Esp A是EPEC抗感染免疫重要中和抗原。結(jié)果:
【關(guān)鍵詞】：EPEC Bfp A EspA Intimin 原核表達(dá) 抗血清 粘附
【學(xué)位授予單位】：川北醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R392-33
【目錄】：

• 致謝4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 1 材料與方法12-25
• 2 結(jié)果25-36
• 3 討論36-41
• 4 結(jié)論41-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 綜述：致病性大腸桿菌（EPEC）粘附相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展47-57
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 附錄57-59
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷59

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 黃庶識(shí);盧明倩;李冰;周冰;陳麗梅;;重組大腸桿菌表達(dá)可溶性蛋白和包涵體過(guò)程的拉曼光譜實(shí)時(shí)分析[J];中國(guó)激光;2014年12期

  本文關(guān)鍵詞：EPEC粘附相關(guān)分子抗血清制備及其中和能力探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：261983