【摘要】：目的p93和Nelin是近年來(lái)在構(gòu)建成人心臟cDNA文庫(kù)并進(jìn)行新ESTs(expressed sequence tags)分離的基礎(chǔ)上，克隆出的心臟特異表達(dá)的基因。為研究其功能，進(jìn)行基因的原核蛋白表達(dá)與純化。采用分子克隆技術(shù)，分別構(gòu)建p93與Nelin的全長(zhǎng)及缺失體片段的原核表達(dá)載體，并進(jìn)行表達(dá)純化，以獲取p93與Nelin的重組蛋白。 方法(1)攜帶p93全長(zhǎng)的GST融合表達(dá)載體pGEX-5X-p93轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)，產(chǎn)物分別用谷胱甘肽瓊脂糖層析柱和電泳切膠分離純化。(2)設(shè)計(jì)帶有Nco Ⅰ／Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)的引物，，以已構(gòu)建好的質(zhì)粒pGEX-5X-p93為模板，用PCR分別擴(kuò)增出p93全長(zhǎng)及p93的激酶與絲氨酸結(jié)構(gòu)域的C端1 200bp的片段(后者簡(jiǎn)稱(chēng)為p93-C)，并用Nco Ⅰ／Xho Ⅰ酶切PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pET28a(+)，用T4 DNA連接酶分別將其連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒載體pET28a-p93和pET28a-p93-C。質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-p93和pETF28a-p93-C轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，SDS-PAGE進(jìn)行分析，產(chǎn)物用Ni~(2+)金屬螯合吸附層析柱純化。(3)采用Western雜交的方法用抗GST多克隆抗體驗(yàn)證GST-p93蛋白，用抗GST-p93多克隆抗體驗(yàn)證p93-his_6和p93-C-his_6蛋白。(4)Nelin基因的蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)分析。用Kyte-Doolittle方案預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的親水性，Emini方案預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的表面可及性，Welling方案預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的抗原性，Karplus-Schulz標(biāo)準(zhǔn)分析肽鏈柔性，經(jīng)綜合分析以預(yù)測(cè)Nelin基因的B細(xì)胞表位。(5)根據(jù)B細(xì)胞表位，結(jié)合同源比，以Nelin基因所包含的F-actin結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Ig結(jié)構(gòu)域?yàn)閯澐謪^(qū)段標(biāo)志，設(shè)計(jì)3個(gè)Nelin基因的缺失體片段：Nelin-1,1-133aa;Nelin-2,66-252 aa;Nelin-3,227-448aa。其中Nelin-2含有F-actin結(jié)合結(jié)構(gòu)域，Nelin-3含有Ig結(jié)構(gòu)域。(6)利用基因重組技術(shù)構(gòu)建GST融合的原核表達(dá)載體pGEX-5X／Nelin1～3，和C端帶有his_6純化標(biāo)簽的載體pET28a-Nelin-Ⅰ。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE_3)，IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析，Western雜交驗(yàn)證。 結(jié)果(1)GST-p93蛋白獲得了高效表達(dá)，并主要以包涵體形式存在，谷胱甘 廷邊大毋 碩士研究生學(xué)位論文 膚瓊脂糖層析柱純化后雜蛋白較多，電泳切膠分離純化得到了純度在95%以上的 GsT-p93蛋白。(2)成功構(gòu)建了pET28a-p93和pET28a一p93一C原核表達(dá)載體。 P93一c一his。與p93一his6融合蛋白亦均以包涵體形式存在。用鎳離子困iz+)金屬鰲合 吸附層析柱純化得到了純度在95%以上的p93一his6和p93一C一his6蛋白。經(jīng)Bradford 法測(cè)定，100ml菌液誘導(dǎo)后可得到o.smg純化的p93一his6蛋白或Zmg純化的 p93一C一his6蛋白。(3)Western雜交檢測(cè)后確認(rèn)pGEX一SX一p93、pET28a一p93和 pET28a一P93一C的表達(dá)產(chǎn)物均為正確產(chǎn)物。(4) Nelin基因氨基酸序列N端的27~ 39區(qū)段、90一102區(qū)段、158一170區(qū)段可能為B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位區(qū)域。(5)Nelin一l 在pGEX和pET兩套表達(dá)系統(tǒng)中均有較高水平表達(dá)，nelin一2表達(dá)較低，nelin一3 表達(dá)水平極低。選擇帶有his6標(biāo)簽的nehn一!作為純化對(duì)象，經(jīng)Ni2+金屬鰲合層 析純化，得到了nelin一1一his6蛋白，純度在95%以上。 結(jié)論重組GST-p93與Nelin一卜his6蛋白的成功純化使P93與Nelin的多抗和 單抗制備得以完成，p93的激酶與絲氨酸結(jié)構(gòu)域的C端片段在大腸桿菌中的表達(dá) 與純化，為其復(fù)性研究以及進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能研究提供了條件。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2621156