無精癥相關(guān)基因ZNF230的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究與UBE2B基因的突變篩查

發(fā)布時間：2020-04-08 18:59

【摘要】：精子發(fā)生是一個多階段，多步驟的持續(xù)細(xì)胞分裂和分化過程，它受到性染色體和常染色體上一系列基因的調(diào)控。研究表明：鋅指蛋白基因家族作為哺乳動物最大的基因家族之一，參與了精子發(fā)生和成熟的各個階段的表達(dá)調(diào)控。本研究圍繞精子發(fā)生相關(guān)基因的功能研究，共分為三個部分。本課題組先采用mRNA差異顯示獲得了只在正常已育男性睪丸中表達(dá)的EST，然后通過cDNA末端快速擴(kuò)增的方法分離克隆了1個新的鋅指蛋白基因ZNF230，并根據(jù)其cDNA序列，用電子克隆和PCR相結(jié)合的技術(shù)克隆了小鼠的同源基因znf230。初步的研究表明ZNF230可能作為轉(zhuǎn)錄因子在精子形成過程起作用。本課題的目的在于進(jìn)一步研究ZNF230基因表達(dá)的亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。第一部分：首先用綠色熒光蛋白標(biāo)記觀察了人類無精癥相關(guān)基因ZNF230在Cos7細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)及定位。為此構(gòu)建了ZNP230—熒光蛋白融合基因表達(dá)載體，然后經(jīng)真核表達(dá)質(zhì)�！|(zhì)體介導(dǎo)，將其導(dǎo)入Cos7細(xì)胞系。熒光顯微鏡觀察顯示：在空白載體pEGFP-N1轉(zhuǎn)染的Cos細(xì)胞中熒光布滿整個細(xì)胞，而在轉(zhuǎn)染陽性載體pEGFP-ZNF230的Cos細(xì)胞中熒光主要聚集在細(xì)胞核中。表明轉(zhuǎn)染的Cos細(xì)胞系能高效表達(dá)人四川大學(xué)碩士學(xué)位論文多1汽炙矽蛋白，表達(dá)的蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)。第二部分:為了從轉(zhuǎn)錄水平揭示ZNF23O基因的調(diào)控機(jī)制，首先克隆了全長為1.Zkb的ZNF23O基因轉(zhuǎn)錄5’端上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)片斷。再用 ZNF230基因5’側(cè)翼序列的各缺失片段與帶熒光素酶報(bào)告基因的pGL3融合構(gòu)建了重組質(zhì)粒。然后用這些攜帶報(bào)告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化HEK293細(xì)胞，并測定了其瞬時表達(dá)的熒光素酶活性。結(jié)果表明ZNF230基因的基本啟動子元件位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游一134至十149bp。該序列缺乏通用的TATA box，，但包含有一個位于一33bp處的Spl的結(jié)合位點(diǎn)，后者對于基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄起著重要作用。為進(jìn)一步確認(rèn)SPI位點(diǎn)的功能，我們利用定點(diǎn)突變等技術(shù)確認(rèn)了SPI 位點(diǎn)對于ZNF23O基礎(chǔ)表達(dá)的重要性。上述研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明ZNF230 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了基礎(chǔ)。 Soxs是一個與精細(xì)胞特異表達(dá)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。為了闡明它是否參與了ZNF23O的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，我們構(gòu)建了重組Soxs真核表達(dá)載體，并用脂質(zhì) 體介導(dǎo)將該質(zhì)粒與含有ZNF230基因基本啟動子元件的重組pGL一載體共轉(zhuǎn)染了培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了Soxs真核表達(dá)載體的熒光素酶活性比單獨(dú)轉(zhuǎn)染PGL一3載體活性明顯增加，提示Soxs蛋白可能參與了ZNF23O精細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。第三部分:精子發(fā)生相關(guān)的基因突變是導(dǎo)致原發(fā)不育的重要原因。已知UBEZB對于精母細(xì)胞的減數(shù)分裂十分重要。為了闡明UBEZB基因在原發(fā)無精癥中的作用，我們在157例無精癥和69例健康已育男性中用 DHPLC法對該基因全部外顯子進(jìn)行了突變篩查。結(jié)果在外顯子3第二氨基酸的位置篩查到1個A一G的核普酸變異，使精氨酸變?yōu)楦拾彼幔珜?照組未發(fā)現(xiàn)該突變。后者的病理學(xué)意義正在進(jìn)一步研究中。關(guān)鍵詞:無精癥ZNF230 UBEZB基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控突變篩查變性高效液相色譜
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