【摘要】：周圍神經(jīng)損傷后，局部發(fā)生華氏變性，雪旺細(xì)胞增生活躍，合成分泌細(xì)胞表面粘附分子(CAMs)、細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合物(ECM)以及多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。因此關(guān)于雪旺細(xì)胞的相關(guān)研究日益得到重視。關(guān)于雪旺細(xì)胞研究的第一步就是雪旺細(xì)胞的體外培養(yǎng)，所面臨的主要問(wèn)題就是如何在解決成纖維細(xì)胞污染的同時(shí)促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖。自上世紀(jì)七十年代至今，關(guān)于雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法例如酶消化法、組織塊法、抗有絲分裂法等逐漸發(fā)展成熟并得到廣泛應(yīng)用。這些方法均能夠有效的去除成纖維細(xì)胞以及促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖。但是隨著研究的深入，對(duì)雪旺細(xì)胞純度的要求越來(lái)越高，單憑某一種培養(yǎng)方法已難達(dá)到要求，而常常需要將多種方法聯(lián)合運(yùn)用以期在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量多、純度高、狀態(tài)好的雪旺細(xì)胞。 雖然雪旺細(xì)胞可以通過(guò)分泌大量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)損傷神經(jīng)修復(fù)，但是由于所分泌的諸多因子在體內(nèi)并不穩(wěn)定并且容易 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 降解，因此對(duì)于神經(jīng)修復(fù)過(guò)程來(lái)說(shuō)仍顯不足�；蜣D(zhuǎn)染可以解決 這個(gè)問(wèn)題。將編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因片斷通過(guò)載體導(dǎo)入雪旺細(xì) 胞即可以實(shí)現(xiàn)目的基因的持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)。目前用于實(shí)驗(yàn)研究的 載體有很多，，其中腺病毒載體以其滴度高、可感染分裂期及非分 裂期宿主細(xì)胞以及病毒基因組并不整合到宿主染色體等特點(diǎn)而 得到重視。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用多種雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)方法獲得高純 度的雪旺細(xì)胞，然后將攜帶有LacZ基因的整合了四環(huán)素調(diào)控框 的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞，在誘導(dǎo)物存在下檢測(cè)目的基因 的定性及定量表達(dá)。探討了應(yīng)用整合有四環(huán)素調(diào)控框的重組腺病 毒載體系統(tǒng)攜帶治療基因轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞以促進(jìn)損傷神經(jīng)功能恢 復(fù)的可行性。本實(shí)驗(yàn)分為以下幾部分: 一、雪旺細(xì)胞原代培養(yǎng)。為了在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量大、純度 高、狀態(tài)好的雪旺細(xì)胞，采取6一7天SD乳鼠坐骨神經(jīng)，采用 酶消化法、差速貼壁法分離獲得雪旺細(xì)胞、Ara一C與G418聯(lián)合 應(yīng)用以去除成纖維細(xì)胞、牛腦垂體提取物(BPE)以促進(jìn)雪旺細(xì) 胞增殖，以及采用低濃度胰酶消化法傳代等一系列步驟。結(jié)果經(jīng) 形態(tài)學(xué)及S一100蛋白相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定證實(shí)所獲 得的雪旺細(xì)胞狀態(tài)較好，純度較高，可達(dá)90%以上。 二、BPE對(duì)雪旺細(xì)胞促增殖作用的研究。探討B(tài)PE對(duì)體外 培養(yǎng)雪旺細(xì)胞增殖作用的影響以及確定BPE應(yīng)用的最佳濃度。 具體方法是:將第二代雪旺細(xì)胞分為五組，分別加入不同濃度的 BPE(50拌g/ml、1 00林g/ml、1 50卜g/ml、200拼g/ml)，并以不加BPE 作為對(duì)照。在加入BPE后于第二、四、六、八天每組分別作S一100 蛋白相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色，對(duì)雪旺細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分別 計(jì)數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示BPE對(duì)雪旺細(xì)胞有明顯促增 殖作用;當(dāng)BPE濃度為1 00件g/ml時(shí)，對(duì)成纖維細(xì)胞分裂影響較 小同時(shí)對(duì)雪旺細(xì)胞保持了有效的促增殖作用。 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 三、腺病毒載體的體外擴(kuò)增、滴度測(cè)定。為了對(duì)腺病毒載體 系統(tǒng)Adeno一x Tet一on system進(jìn)行擴(kuò)增以供進(jìn)一步轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng) 雪旺細(xì)胞，將腺病毒載體感染HEK293細(xì)胞，待CPE現(xiàn)象明顯時(shí) 采用反復(fù)凍融法收獲病毒，然后將收獲的病毒再次感染HEK293 細(xì)胞，收獲病毒，重復(fù)三次。對(duì)最后一次收獲的病毒采用噬斑檢 測(cè)法(plaque assay)進(jìn)行滴度測(cè)定，結(jié)果顯示三輪擴(kuò)增后Adeno一x Tet一On regulato汀 Virus和Adeno一X TRE一pgal Control Virus滴度分 別為:l.26x logpfi刀ml;l.99xlogpfi刀Inl。 四、Aden。一x Tet一on system轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞的研究。探討將重 組腺病毒載體Adeno一x Tet一OnS州em轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞后，在誘導(dǎo)物 強(qiáng)力霉素(Doxyeyeline，DOX)存在下LacZ基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況。 采取以下方法:1.在DOx劑量確定的情況下(2林留ml)，使用不 同滴度的病毒轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞，對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物p一半乳糖普酶 (p一galactosidase，p一gal)進(jìn)行定量檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 學(xué)分析，確定轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞的最適滴度。然后依據(jù)此滴度將腺病 毒載體轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞，隨著DOX濃度的變化，對(duì)p一gal的誘導(dǎo)表 達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)、繪制誘導(dǎo)表達(dá)曲線并作定性鑒定。結(jié)果:當(dāng) M.o.x(multip一ieity ofinfeetion)=60 pfu/eell時(shí)即可獲得p一gal的最 高表達(dá)。通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)曲線可以看出隨著DOX濃度的不斷增加， p一gal的表達(dá)量也隨之增加。但當(dāng)DOX達(dá)到一定濃度后，p一gal的 表達(dá)量不再隨之增加，即已達(dá)最高表達(dá)量。 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們可以得出以下結(jié)論: 1.通過(guò)將酶消化法、差速貼壁法、Ara一C與G4 18、牛腦垂體 提取物(BPE)、以及低濃度胰酶消化法聯(lián)合運(yùn)用可以在短時(shí)間 內(nèi)獲得純度高、狀態(tài)好的原代培養(yǎng)雪旺細(xì)胞。 2.適當(dāng)濃度的牛腦垂體提取物(BPE)可以有效的促進(jìn)雪 旺細(xì)胞增殖。 3.使用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增腺病毒載體、噬斑檢測(cè)法(Plaque 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 assay)測(cè)定病毒滴度，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得高滴度的腺病毒載 體。 4.使用Adeno一X Tet一On System轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)劑 可以實(shí)現(xiàn)目的基因的可調(diào)控、高效表達(dá)。為以后攜帶相關(guān)治療基 因轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞促進(jìn)損傷神經(jīng)修復(fù)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2616241