【摘要】：白細(xì)胞介素24(Interleukin-24，IL-24)原先被命名為黑色素瘤分化相關(guān)基因7(melanoma differentiation-associated gene 7，mda-7)，是1995年由美國哥倫比亞大學(xué)的Jiang等人發(fā)現(xiàn)的一種新型細(xì)胞因子。他們將體外腫瘤誘導(dǎo)分化治療模型—黑色素瘤細(xì)胞，經(jīng)人成纖維細(xì)干擾素(IFN-β)和蛋白激酶C的激活劑mezerein(MEZ)共同處理后，誘導(dǎo)其生長抑制并引發(fā)了終末分化，將未處理和處理后黑色素瘤細(xì)胞的cDNA文庫進(jìn)行減數(shù)雜交，從而首次發(fā)現(xiàn)了后者有一新的黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)。2001年，基于對MDA-7基因定位、分子結(jié)構(gòu)和細(xì)胞因子樣特性的研究發(fā)現(xiàn)，人類基因命名委員會正式將其命名為白細(xì)胞介素24(IL-24)。 目前的研究表明，IL-24具有較明顯的抗腫瘤作用，能選擇性地抑制腫瘤生長，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，以及引起黑色素瘤細(xì)胞末端分化。而有關(guān)其免疫學(xué)功能的研究尚不系統(tǒng)。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)是目前已知的功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells,APC)，具有刺激初始T細(xì)胞增殖的獨(dú)特功能。成熟的DC表達(dá)高水平的Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-Ⅱ)、共刺激分子(CD80、CD86)以及某些粘附分子等。成熟的DC可將抗原提呈給T細(xì)胞，從而活化T細(xì)胞，啟動免疫應(yīng)答�；贒C的重要功能和在機(jī)體特異性免疫中的關(guān)鍵地位，我們設(shè)想IL-24的抗腫瘤作用可能與其激活了免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)，例如，IL-24可能激活抗原提呈細(xì)胞，增強(qiáng)其抗原遞呈能力，從而引發(fā)了抗腫瘤免疫應(yīng)答。因此，我們觀察了IL-24對DC成熟和功能的調(diào)控作用。 本研究包括兩部分內(nèi)容。 一、重組人IL-24蛋白的表達(dá)、純化和鑒定 取新鮮健康成人外周血經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離獲得外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，用脂多糖(LPS)體外處理PBMC 24小時后，提取細(xì)胞的總mRNA，在oligo-dT15的引導(dǎo)下反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后以此為模板，采用PCR擴(kuò)增獲得人IL-24 cDNA，將其插入pQE30表達(dá)載體，經(jīng)酶切和測序篩選出正確的重組表達(dá)質(zhì)粒后，，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌M15(pREP4)，轉(zhuǎn)化子在2YT培養(yǎng)基中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)， 第二軍醫(yī)大學(xué)碩士論文 經(jīng)SDS一PAGE觀察到約1 9 .6kDN端帶有6個組氨酸(His)尾的IL一24重組蛋白 的表達(dá)，其主要以包涵體的形式存在于細(xì)菌胞內(nèi)。為了得到?jīng)]有LPS污染的工L一24 蛋白，包涵體經(jīng)多次充分洗滌后，用7M鹽酸肌溶解。變性蛋白通過His尾結(jié)合 到Ni‘鰲合柱進(jìn)行初步純化，然后在體外經(jīng)精氨酸和甘油復(fù)性后，用HitraPQ 離子交換層析柱進(jìn)一步純化。純化的重組IL一24蛋白經(jīng)SDS一PAGE電泳銀染，證 實(shí)其純度大于95%，用堂試劑檢測LPS含量小于0.03pg/ug蛋白。 二、重組IL一24蛋白對人DC成熟和功能的影響 1.不同狀態(tài)的DC表達(dá)IL一24受體的分析 按常規(guī)方法培養(yǎng)至第五天的非成熟DC，分別加入lug/m1工L一24或lug/ml LPS 刺激40小時，收獲DC，用以p一aCtin為內(nèi)參進(jìn)行RT一PCR分析IL一24受體mRNA 表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL一24受體的IL一22RI單體表達(dá)水平在成熟DC有明顯的 上調(diào)，IL一20R2表達(dá)水平在成熟和未成熟DC上沒有明顯的差異，而IL一20RI 在上述兩種狀態(tài)下的Dc中均未見有表達(dá)。lug/ml IL一24作用Dc可上調(diào)其 IL一22RI的表達(dá)，而其它兩個受體單體的表達(dá)與未成熟DC相比，沒有顯著差別。 提示IL一24在DC發(fā)揮生理功效可能是通過IL一22RI八L一ZORZ受體異二聚體介導(dǎo) 的。 2.IL一24誘導(dǎo)DC分泌細(xì)胞因子 用ing/ml、10ng/ml、100ng/ml、lug/ml IL一24或lug/ml LPs分別刺激培 養(yǎng)至第五天的DC，24小時后用定量ELISA方法測定上清中工L一6、IL一12、1L一1 p、TNF一Q的含量，為排除所用蛋白中含有LPS的可能，我們又設(shè)置了重組IL一24 煮沸熱變性對照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL一24能誘導(dǎo)DC產(chǎn)生工L一6、工L一12、IL一lp、TNF- a，并且存在著劑量依賴效應(yīng)。變性處理的IL一24則不再有誘導(dǎo)DC產(chǎn)生這四種 細(xì)胞因子的能力。這些結(jié)果表明，工L一24具有誘導(dǎo)DC分泌IL一12等Thl類細(xì)胞 因子和IL一6、兒一lp、TNF一Q等促炎性細(xì)胞因子的能力。 3，IL一24誘導(dǎo)DC分泌趨化因子 按常規(guī)方法培養(yǎng)至第五天的非成熟oC，分別與Ing/ml、10ng/ml、loong/ml、 lug/ml重組工L一24蛋白繼續(xù)共孵育36小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用定量ELISA 試劑盒檢測上清中IP一10和MIP一IQ的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種趨化因子的產(chǎn)生 水平與IL一24的作用呈顯著的劑量依賴關(guān)系，并據(jù)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇lug/m1工L一24 第二軍醫(yī)大學(xué)碩士論文 與DC分別作用0、12、24、36小時，發(fā)現(xiàn)IL一24刺激DC分泌IP一10和MIP一la 隨著時間進(jìn)程呈現(xiàn)一定得趨勢。IP一10分泌量略微升高，而M工P一la的分泌量則 明顯下降。同時在工L一24煮沸熱變性對照組沒有檢測到DC分泌上述兩種趨化因 子，而LPS刺激的陽性對照組檢測到了較高水平的上述兩種趨化因子的分泌。表 明該作用是工L一24的生物學(xué)功能，而不是其重組蛋白中可能會有的LPS污染。 4.工L一24促進(jìn)DC功能成熟 將培養(yǎng)至第五天的非成熟De，經(jīng)long/ml、100ng/ml、lug/ml IL一24作用 48小時后，流式細(xì)胞儀檢測DC表型，結(jié)果與空白對照組相比，DC表面CDSO、 CD86、HLA一DR分子均明顯上調(diào)，同時在lug/ml LPS陽性對照組也觀察到相一致 的結(jié)果，提示I
【圖文】：

第二軍醫(yī)大學(xué)碩士論文圖3Fig.3Identifieation重組表達(dá)質(zhì)粒Pqe30一IL一24的酶切鑒定ofveetorPQE30一IL一24byBamHIandHindllldigestionLane1.PQE30一IL一24;Lane2.PQE30圖4重組表達(dá)質(zhì)粒pQE3O一IL一24的測序分析結(jié)果Fig.4SequeneingresultesofveetorPQE30一IL一24

GTO36對該重組質(zhì)粒進(jìn)行全自動測序分析，測序結(jié)果表明(圖4)，BamHI和Hindln位點(diǎn)間的插入序列與人IL一24cDNA編碼序列完全相符，插入位置與讀框也全部正確。表明我們重組構(gòu)建的載體pQE30一IL一24是正確的。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392

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本文編號：2614936