發(fā)布時(shí)間：2020-03-28 08:56

【摘要】：研究背景 造血干細(xì)胞移植是治療惡性血液病、再生障礙性貧血、實(shí)體瘤、免疫缺陷病和重度急性放射病的有效方法。然而，由于造血干細(xì)胞的來(lái)源的限制，半數(shù)以上的患者仍無(wú)法接受該項(xiàng)治療。隨著干細(xì)胞生物工程的發(fā)展，人們?cè)噲D通過體外擴(kuò)增造血干／祖細(xì)胞以滿足臨床的需求。傳統(tǒng)的造血干／祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，大多局限于幾種造血因子如IL-3，IL-6，SCF，EPO等細(xì)胞因子的聯(lián)合應(yīng)用，在體外刺激造血干細(xì)胞的擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)證明，在這種培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的造血干／祖細(xì)胞，其自我更新的能力逐漸減弱，更容易分化為某種特定的成熟細(xì)胞，難以獲得足夠的重建造血的干細(xì)胞數(shù)量。因此，如何模擬體內(nèi)造血微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)造血干／祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增，在理論及臨床應(yīng)用上都具有重要的意義。 造血干細(xì)胞是一群存在于造血組織，具有自我更新及定向分化潛能的造血細(xì)胞，目前，對(duì)于造血干細(xì)胞的增殖及分化的分子調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全清楚，認(rèn)為可能是通過細(xì)胞因子及細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互接觸來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。Notch信號(hào)途徑在生物進(jìn)化中高度保守，主要調(diào)控細(xì)胞的分化方向，它廣泛存在于多種生物體內(nèi)，從果蠅、線蟲到人類，與多種細(xì)胞、組織、器官 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，Jaggedl作為Notch的配體，它由1218個(gè)氨基 酸組成，，是I型跨膜蛋白，其胞外段含有16個(gè)EGF(EPid~al Grov改h Factor)樣重復(fù)序列，并含有一個(gè)富含半朧氨酸的DSL (Delta一serra1Le一Lag一2)基序(motif)，這一基序在與Notch的相 互作用中起關(guān)鍵作用。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，人造血干/祖細(xì)胞表面存在 Notch受體的表達(dá)，而在骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面存在Ja留edl的表達(dá)， 提示Notoh信號(hào)途徑可能對(duì)造血干/祖細(xì)胞的自我更新與增殖起 重要作用，有研究表明Notch可以抑制造血干/祖細(xì)胞的分化， 但是能夠促進(jìn)其增殖。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑榱诉M(jìn)一步研究Jaggedl在造血干/祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增 中的作用，構(gòu)建含人Jaggedl胞外段一IgFc融合基因片段的質(zhì)粒， 并在真核細(xì)胞中表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)方法從正常人的骨髓細(xì)胞中提取總RNA，根據(jù)GenBank中 人Jaggedl基因的堿基序列，按照引物設(shè)計(jì)原則，針對(duì)Jaggedl基 因的胞外段設(shè)計(jì)引物。并經(jīng)RT一PCR擴(kuò)增出Jaggedl基因的胞外 段編碼序列，測(cè)序結(jié)果證實(shí)與文獻(xiàn)報(bào)道完全一致;將Jaggedl基 因的胞外段插入到融合有人IgGIFc基因組片段的克隆載體 PBluescriPt SKll中，以獲得hjaggedl‘一Fc融合基因。將 hjaggedl‘對(duì)一Fc融合基因定向插入真核表達(dá)載體pEF一BOSne。中， 構(gòu)建重組真核表達(dá)載體PEF一BOSne。一hjaggedl叭Fc;瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 COs7細(xì)胞后，再次利用RT一PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)hjaggedl喇一Fc 融合基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè);直接免疫熒光檢測(cè)Uaggedl喇一c 融合蛋白在COS7細(xì)胞中的表達(dá)，夾心ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清 中hjag羅dl晚一Fc融合蛋白的分泌表達(dá)情況。以醉F一OSne。- hJ昭g刃l(wèi)’爪一Fc質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染X63細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)hjaggedl叭 Fc融合蛋白的細(xì)胞株，ELISA檢測(cè)hjaggedl嘆Fc融合蛋白的表 達(dá)效率。 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 實(shí)驗(yàn)結(jié)果hjaggedl的胞外段被有效的擴(kuò)增，DNA序列分析表明 所構(gòu)建的含hjaggedlext一Fc融合基因的質(zhì)粒與預(yù)期設(shè)計(jì)相同， hjaggedl硯一Fc融合蛋白得到正確的表達(dá)。X63穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株 hjaggedlext一Fc融合蛋白的分泌表達(dá)量為3拌留扣工。 實(shí)臉討論本研究成功地構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEF一OSneo一hjag .gedl一Fc，并初步證實(shí)hjaggedi硯一Fc融合蛋白能夠在真核細(xì)胞 中分泌表達(dá)。這一結(jié)果為下一步以hJ昭gedl的胞外段為刺激物， 聯(lián)合應(yīng)用不同的造血刺激因子，觀察對(duì)體外擴(kuò)增的造血千/祖細(xì) 胞在數(shù)量及其生物學(xué)功能方面的影響，為解決臨床移植及基因 治療的干細(xì)胞來(lái)源問題奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉英,裴雪濤,呂善根,冉崇蓉,李梁,馮凱,徐黎,白慈賢;擴(kuò)增人臍血造血干/祖細(xì)胞重建SCID小鼠造血的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華血液學(xué)雜志;1999年12期

本文編號(hào)：2604229