發(fā)布時(shí)間：2020-03-28 11:14

【摘要】：單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因和大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(EC-CD)基因是VDEPT系統(tǒng)中兩種研究最深入，應(yīng)用最廣泛的自殺基因，，基因序列及其表達(dá)產(chǎn)物的作用機(jī)制已基本明確。本研究將二者構(gòu)建成融合自殺基因CDglyTK，采用細(xì)菌內(nèi)同源重組法，以復(fù)制缺陷型腺病毒為載體導(dǎo)入真核包裝細(xì)胞系293細(xì)胞中，成功構(gòu)建了含雙自殺基因的重組腺病毒，以期獲得較單自殺基因具有更高抗腫瘤療效的生物治療制劑。 本研究首先從質(zhì)粒pBlueScript-CD中PCR擴(kuò)增出帶有酶切識(shí)別位點(diǎn)的EC-CD基因片段，利用PCR產(chǎn)物兩末端帶有的單個(gè)A堿基，與帶有單個(gè)T堿基末端的PMD18-T載體借助堿基互補(bǔ)相連接，構(gòu)建成質(zhì)粒PMD18-T-CD。從該質(zhì)粒中切下EC-CD片段，與帶有相同粘性末端的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV構(gòu)建成pAdTrack-CMV-CD，并進(jìn)行了PCR和酶切鑒定。HSV-TK基因自質(zhì)粒pAdE1CMV-TK中經(jīng)PCR擴(kuò)增獲取，并通過(guò)設(shè)計(jì)引物使之5’端帶有編碼甘氨酸的寡核苷酸鏈，最終獲得glyTK。glyTK基因和質(zhì)粒pAdTrack-CMV-CD經(jīng)酶切、連接構(gòu)建成含融合自殺基因的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-CDglyTK，并采用PCR擴(kuò)增、酶切以及對(duì)插入片斷進(jìn)行測(cè)序這三種方法進(jìn)行鑒定。 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建采用了細(xì)菌內(nèi)同源重組法，將經(jīng)Pme Ⅰ酶切線性化的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-CDglyTK和帶有腺病毒主要基因組的骨架質(zhì) 天津醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 粒pAdEasy一l共同轉(zhuǎn)化至具有高同源重組能力的BJS 183菌中， 病毒質(zhì)粒pAdEasy一GFP一CDglyTK。經(jīng)卡那霉素初篩、酶切和 構(gòu)建成重組腺 PCR鑒定正確 后，再將其轉(zhuǎn)化至DHS。菌中，以獲取足量拷貝的重組質(zhì)粒。用脂質(zhì)體法將 其轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝、擴(kuò)增出含融合自殺基因的重組腺病毒rAd一CDglyTK， 從而為進(jìn)一步用于惡性腫瘤基因治療的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究以及最終的臨床應(yīng) 用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 另外，在構(gòu)建重組腺病毒rAd一CDglyTK時(shí)，本研究從方法學(xué)上進(jìn)行了較 為深入的探討，對(duì)所選用的AdEasy系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)。既可使該系統(tǒng)不需再 借助昂貴的儀器，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)在一般性實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行質(zhì)粒的細(xì)菌內(nèi)重組，節(jié)省 了財(cái)力，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍;同時(shí)也保證了較高的細(xì)菌內(nèi)同源重組的成功率。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 魏道嚴(yán),糜軍,陳詩(shī)書(shū);細(xì)菌內(nèi)同源重組法高效制備含CD、TK融合自殺基因重組體腺病毒[J];癌癥;2000年05期

2 朱乃軍,李秋香,李冬田,孫文敏,佟惠春;含HSV1-TK基因重組腺病毒的構(gòu)建及對(duì)小鼠肺癌的抑制作用[J];實(shí)用腫瘤雜志;2002年04期

3 李芳芳,李冬田,佟惠春,李菲,李光明;重組腺病毒AdCD體外抑瘤作用的研究[J];天津醫(yī)藥;2002年05期

本文編號(hào)：2604376