【摘要】： TDI-FP技術(shù)是一種全新的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)分析技術(shù)，它采用熒光偏振(Fluorescence Polarization，F(xiàn)P)為檢測(cè)手段，是在TDI(Template-directed Dye-terminator Incorporation)法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展和完善而成。TDI-FP技術(shù)具有非常高的特異性和敏感性，而且操作簡(jiǎn)便，可以實(shí)現(xiàn)SNP的自動(dòng)化和高通量分析。 為了推廣TDI-FP技術(shù)在我國(guó)SNP基礎(chǔ)研究和臨床疾病相關(guān)SNP或者點(diǎn)突變的檢測(cè)中的應(yīng)用，該課題利用TDI-FP技術(shù)建立了高通量單核苷酸多態(tài)性分析系統(tǒng)，并對(duì)HBV YMDD基序拉米夫定(LAM)耐藥相關(guān)點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)來(lái)驗(yàn)正系統(tǒng)的準(zhǔn)確性和可行性。 通過(guò)YMDD基序定點(diǎn)誘變質(zhì)粒對(duì)高通量單核苷酸多態(tài)性分析系統(tǒng)的PCR反應(yīng)體系和PCR產(chǎn)物消化時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。該系統(tǒng)的PCR反應(yīng)體系為： 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 總體積50pl，其中包括10x反應(yīng)緩沖液5葉二5＊＊。卜L噸CI二3卜1、二．5卜＊。1／L ＊＊＊＊2．＊1、25卜＊。兒引物＊ 和n各0．印I、hq＊＊A聚合酶（SU／pl）O．5“ DNA 模板 … 和 ddHZO 37yi，使得 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的濃度在 1．18ng／卜l一7刀sng／卜1范困內(nèi)。為了保證把 5卜IPCR產(chǎn)物中乘u余 dNTPs牙口弓物 完全消化，最終確定至少于 3 7 C孵育 1刀h。 利用該系統(tǒng)對(duì)35例PCR陽(yáng)性的HBV感染者血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)YMDD 野生型26例、YVDD突變型2例、YVDD／YMDD突變混合型二例、YIDD 突變型二例，YIDD／YMDD突變餛合型 1例，其中有兩例在 74位 G，。；＋T 的檢測(cè)結(jié)果為陰性，經(jīng)測(cè)序證明，其發(fā)生了C741突變型（YIDD）。把PCR產(chǎn) 物與 pGEM丁 Easy載體重組進(jìn)行測(cè)序結(jié)果與高通量單核昔酸多態(tài)性分析系統(tǒng) 檢測(cè)結(jié)果完全一致，特異性為 100％。山于該系統(tǒng)的敏感性與 PCR反應(yīng)體系 的敏感性直接相關(guān)，所以其敏感性為 92．l％。 山于TDI－FP技術(shù)具有非常高的特異性和敏感性，而且操作簡(jiǎn)便，，可以實(shí) 現(xiàn)自動(dòng)化和高通量檢測(cè)，因此其在研究病原微生物基因突變、人類(lèi)基回組單 核昔酸多態(tài)性、藥物基因組學(xué)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。 為了實(shí)現(xiàn)高通量單核昔酸多態(tài)性分析系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的自動(dòng)化分析，我們 以 Exel作表為依托，用 Visual Basic語(yǔ)言編寫(xiě)軟件代碼，開(kāi)發(fā)了 HBV DNA 突變高通量單核昔酸多態(tài)性分析系統(tǒng)檢測(cè)軟件。該軟件主要針對(duì)HBV基因組 四個(gè)開(kāi)放讀碼框的主要點(diǎn)突變進(jìn)行進(jìn)行半自動(dòng)化基因型分析，檢測(cè)者可以根 據(jù)樣品的mP值和在散點(diǎn)圖中分布，來(lái)分析其突變類(lèi)型。該軟件的設(shè)計(jì)為以 后開(kāi)發(fā)適用于人類(lèi)單核昔酸多態(tài)性完全自動(dòng)化分析研究軟件“ SNP Scorer”打 下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類(lèi)號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2596541