【摘要】：根據(jù)已發(fā)表的副溶血弧菌耐熱直接溶血素(TDH)的核苷酸序列設(shè)計了一對引物，并在5’-端與3’-端分別增加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，應(yīng)用PCR技術(shù)從致病性副溶血弧菌wVp_2株擴(kuò)增了tdh基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切回收后定向插入pGEX-4T-1表達(dá)載體，測序分析結(jié)果表明tdh基因的開放閱讀框(ORF)為570nt，編碼由189個氨基酸組成、分子量為23kDa的耐熱直接溶血素。應(yīng)用DNAman、Antheprot 5.0、ClustalW等分子生物學(xué)軟件分析，顯示所克隆的tdh基因與Genebank副溶血弧茵的tdh1基因(M10069)同源率達(dá)99.82％，僅在368位與參考菌株有一堿基差別(A-G)；推導(dǎo)的氨基酸僅123位由天冬氨酸替代了TDH1的甘氨酸，同源率達(dá)99.47％，前24個氨基酸是較強(qiáng)的疏水性區(qū)域，可能組成信號肽。 將PCR產(chǎn)物與pGEX-4T-1構(gòu)建的重組質(zhì)粒成功的轉(zhuǎn)化了E．coli DH5α與BL21(DE)工程菌株，SDS-PAGE分析表明經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后重組菌在遷移率為49kD位置上出現(xiàn)一條明顯的蛋白帶，而其載體自身帶有26kDGST蛋白帶消失，，由此推斷，49kD蛋白是由tdh基因編碼的23kD蛋白與gst基因編碼的26kD蛋白連接后形成的融合蛋白。Bio-rad Gel Doc2000，QuantityOne軟件分析表明該融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白含量的32％，表達(dá)產(chǎn)物主要以不溶性蛋白的形式存在于菌體裂解沉淀中，利用5mM二硫蘇糖醇、1.5％十二烷基肌氨酸鈉和0.2％脫氧膽酸鈉等變性劑對不溶性蛋白處理后，能使大部分不溶性蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘鞍�，通過GlutathioneSephrose 4B親和柱層析和Thrombin酶切將GST-TDH融合蛋白從BL21工程菌分離出來。免疫學(xué)分析證實(shí)純化的表達(dá)產(chǎn)物能被副溶血弧菌胞外產(chǎn)物的特異性抗血清所識別，抗血清的ELISA效價為1：32000，當(dāng)抗血清稀釋度為1：1000時，能檢出的最低TDH蛋白量為31.25ng。DNA序列分析和免疫學(xué)分析證明所克隆的基因是副溶血弧菌的tdh基因，且重組菌表達(dá) 福建農(nóng)林大學(xué)碩士論文 的TDH與原始菌株產(chǎn)生的TDH抗原性一致。副溶血弧菌的才瀚基因克隆 與表達(dá)，為在單因子水平上研究副溶血弧菌TDH的毒力、致病機(jī)理以及 誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答方面的作用奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

菌;抽提的重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和EcoRI酶切后，分別得到大小約為skb和57Obp的兩個片段，與預(yù)期的載體片段和目的基因片段大小一致，表明了重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(見圖3)。再將含目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程菌E.coliBL21，得到重組菌，命名為PWB。2345678910117(X)bP1.50bPDNAladder2.vP北京株3.8#菌株4.23#菌株svp31#5.wvPI7.wvPZ8.wvP39.wvall10.wvaIZ11.wva】3570bP圖1副溶血弧菌才叨二基因的PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.1PCRamPlifieationoftdhgeneofvibrioParahaemolytieus234561.IkbDNAladder2.50bPDNAledder70bp，.酶切pGEx一wVpZ一BLZI質(zhì)粒4.酶切pGEx一wvPZ一DH5a質(zhì)粒5.酶切PET28-wVPZ一BLZI質(zhì)粒6.酶切PET28一wVPZ·DH5a質(zhì)粒圖3重組質(zhì)粒的BamH1/EcoRI酶切鑒定結(jié)果Fig.3CharacteriZationofthereeombinantPlasmids妙BamH硯

結(jié)果與分析1.PCR擴(kuò)增與重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增副溶血弧菌wVp:的tdh57obP(見圖l)，與預(yù)計片段大小一致。將PcR入pGEX一4T-1表達(dá)質(zhì)粒(見圖2)，轉(zhuǎn)化工程菌E菌;抽提的重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和EcoRI酶切后，和57Obp的兩個片段，與預(yù)期的載體片段和目的了重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(見圖3)。再將含目的基因E.coliBL21，得到重組菌，命名為PWB。234567891011
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：Q786

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 吳振龍,聶軍,鮑慧寧,徐兵,王紅;副溶血性弧菌耐熱直接溶血毒素基因的克隆[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2001年02期

2 許斌福,林能鋒,楊金先,俞伏松,董傳甫,林天龍;大黃魚副溶血弧菌的分離、鑒定及致病力分析[J];福建農(nóng)業(yè)學(xué)報;2002年03期

3 張曉華,徐懷恕,許兵,紀(jì)偉尚,韓茵,楊學(xué)宋,馬建康;中國對蝦弧菌病的間接熒光抗體診斷技術(shù)研究[J];海洋與湖沼;1997年06期

4 牟海津,李筠,包振民,楊學(xué)宋,徐懷恕;副溶血弧菌胞外產(chǎn)物對中國對蝦的致病性分析[J];海洋與湖沼;2000年03期

5 高永貴,關(guān)怡新,姚善涇;包涵體蛋白的變復(fù)性研究[J];科技通報;2003年01期

6 陶保華,胡超群,吳蔚;斑節(jié)對蝦弧菌病的病原生物學(xué)研究[J];熱帶海洋學(xué)報;2001年02期

7 萬夕和,裴鴻生,沈懷舜,荊燕,許璞;江蘇南部河蟹幼苗培育系統(tǒng)中致病性弧菌的分離診斷[J];水產(chǎn)養(yǎng)殖;2000年01期

8 彭方,楊銳,李文鑫;一種制備GST融合蛋白親和層析膠的方法[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2002年03期

9 任少堂,劉軍民,秦一中,汪偉業(yè),俞守義;聚合酶鏈反應(yīng)檢測糞便中的副溶血性弧菌的TDH基因[J];上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志;1997年04期

10 彭宣憲,周櫻,王三英,章躍陵;采用UPPCR-SSCP技術(shù)快速鑒定水產(chǎn)養(yǎng)殖病原性弧菌的研究[J];臺灣海峽;2000年04期

本文編號：2595225