【摘要】： MAE是本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的具有抗菌活性的雜合肽，它是以MagaininⅡ(殘基4-14)和Melittin(殘基2-13)為親本，并對序列進(jìn)行了優(yōu)化改造后設(shè)計(jì)出的雜合肽。本文對雜合肽的高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬，得到了該雜合肽高級結(jié)構(gòu)的初步信息。并以已構(gòu)建的載體pTYB2-mae為模板，通過PCR擴(kuò)增出融合基因mae-imein-cbd，將其克隆于表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K中，通過鑒定并測序正確后，電轉(zhuǎn)化真核表達(dá)宿主——畢赤酵母菌株GS115，通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選重組子，再利用G418抗性篩選出整合有多拷貝外源基因的重組子。按表達(dá)手冊進(jìn)行表達(dá)實(shí)驗(yàn)，挑選出具有高分泌表達(dá)水平的菌株，并采用不同的誘導(dǎo)時間、pH值、甲醇誘導(dǎo)濃度進(jìn)行表達(dá)比較，優(yōu)化出適宜的表達(dá)條件。采用優(yōu)化的表達(dá)條件進(jìn)行大量發(fā)酵，對上清液超濾濃縮脫鹽后，采用幾丁質(zhì)基質(zhì)進(jìn)行親和層析分離目的蛋白，溴化氰切割，瓊脂孔穴法測抗菌活性。結(jié)果表明，純化后的產(chǎn)物具有明顯的抗菌活性。 Misgurin是一種從泥鰍中分離出來的，具有強(qiáng)抗菌活性而無溶血活性的抗菌肽，因而有望成為一種抗菌新藥。本文根據(jù)GENEBANK登錄的氨基酸序列，同時考慮構(gòu)建和表達(dá)的需要，化學(xué)合成了misgurin基因和接頭，采用一種新的策略，在體外將基因多拷貝同向串連，并將其克隆于表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K中，通過鑒定并測序正確后，電轉(zhuǎn)化真核表達(dá)宿主——畢赤酵母菌株GS115，通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選重組子，再利用G418抗性篩選出整合有多拷貝外源基因的重組子。按表達(dá)手冊進(jìn)行初步表達(dá)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)SDS-PAGE檢測表明，酵母重組子分泌出了目的蛋白。
【圖文】：

n兩種基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其在畢赤酵母中的表達(dá)2.基因和接頭的連接基因和接頭最終連接產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖18，，從圖中可以看出連接產(chǎn)物能形成明顯的一條條帶，且基因片段長能高達(dá)IKb以上，也即能獲得較高的拷貝數(shù)(20個拷貝左右)。出于MISGU刃N是陽離子多膚，過高的拷貝數(shù)會影響表達(dá)量[l“’]的考慮，我們只回收4個拷貝的串連基因。100b衛(wèi)—500bP—M:100bPladder1000bPLanel:連接產(chǎn)物圖18最終連接產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖3.轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定及測序連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌DHS。，涂布在含Amp的抗性篩選LB平板上。設(shè)置的對照與預(yù)期相符，說明轉(zhuǎn)化過程正常。挑取20個轉(zhuǎn)化子

結(jié)果進(jìn)一步的支持了關(guān)于抗菌膚是無受體介導(dǎo)的過程�！按┛啄Ｐ�(barrel一stavemodel)”和“地毯模型(e抑etmodel)”是目前關(guān)于抗菌膚膜活性作用過程的兩種最常見的模式。它們的作用模式圖如圖3。圖3:抗菌膚的兩種作用模式，左邊為地毯模型，右邊為穿孔模型暨南大學(xué)碩十畢業(yè)論文
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：Q78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 梁偉鋒,張朝春,楊希才;一種多拷貝畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)[J];微生物學(xué)報;2005年01期

2 王清路,張銳,倪萬潮,陳毓荃,郭三堆;透明顫菌血紅蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在畢赤酵母中的表達(dá)研究[J];生物工程學(xué)報;2004年05期

3 扈進(jìn)冬;吳遠(yuǎn)征;張廣志;楊合同;;天蠶抗菌肽B基因在畢赤酵母中多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建[J];山東科學(xué);2008年05期

4 姜瓊;;抗菌肽P113多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建[J];宜春學(xué)院學(xué)報;2011年04期

5 戴文建,彭淑平,張曼,周建國,董林,曹建國;血管基膜衍生多功能肽基因在畢赤酵母中的表達(dá)和活性鑒定[J];湖南師范大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2005年01期

6 王云起,劉飛鵬,李月琴,張欣,蔡繼業(yè);天蠶素A-蜂毒素雜合肽用pBV220載體的表達(dá)、純化和活性測定[J];中國生物工程雜志;2005年10期

7 王蓮哲;張現(xiàn)青;李洋;楊廣笑;何光源;;畢赤酵母分泌表達(dá)SAMS及表達(dá)產(chǎn)物活性分析[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年10期

8 米東;楊爽;胡芬;張杰;喬玉歡;杜君;朱天慧;;人骨形態(tài)發(fā)生蛋白6(hBMP6)在畢赤酵母中的分泌表達(dá)[J];南開大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2010年01期

9 邵明龍;趙宏鑫;楊蘋;萬曉珊;孔祥鑫;王會巖;李校X;;人成纖維細(xì)胞生長因子21基因的克隆及在畢赤酵母中的表達(dá)[J];吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2010年04期

10 馬建榮;余永紅;張景海;;畢赤酵母中抗癌鎮(zhèn)痛肽肺靶向融合體表達(dá)載體——穿梭質(zhì)粒pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP的構(gòu)建[J];生物學(xué)雜志;2011年05期

相關(guān)會議論文 前10條

1 韓學(xué)海;中野明彥;;釀酒酵母分泌缺陷株sec12的多拷貝抑制基因分析[A];第七屆全國生物膜學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編[C];1999年

2 汪昌麗;黃生平;馬立新;;酵母多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建[A];中國蛋白質(zhì)組學(xué)第三屆學(xué)術(shù)大會論文摘要[C];2005年

3 譚禾畔;朱江;Wayne A.Hendrickson;;基于結(jié)構(gòu)的HIV-1入侵抑制劑計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)[A];科技、工程與經(jīng)濟(jì)社會協(xié)調(diào)發(fā)展——中國科協(xié)第五屆青年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2004年

4 張亞芳;潘存紅;李愛宏;湯雯;武茹;陳宗祥;許愛霞;潘學(xué)彪;;提高水稻插入突變體庫利用效率的一點(diǎn)嘗試[A];江蘇省遺傳學(xué)會第七屆代表大會暨學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2006年

5 杜培革;李賀;安麗萍;呂剛;敬舒;;多拷貝重組人肝細(xì)胞生長因子(rhHGF)基因畢赤酵母分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建[A];2005全國第二屆核酸疫苗研討會論文集[C];2005年

6 袁曉東;劉博;湯敏謙;;應(yīng)用MPSS技術(shù)進(jìn)行MicroRNA Profiling的介紹[A];第六次全國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)術(shù)會議文摘匯編[C];2005年

7 常穎;屈淑平;崔崇士;;Fad2基因的研究與應(yīng)用進(jìn)展[A];中國園藝學(xué)會南瓜分會西南地區(qū)南瓜產(chǎn)業(yè)化發(fā)展研討會暨第三屆會員代表大會論文集[C];2009年

8 謝家建;李飛武;王錫鋒;彭于發(fā);;我國水稻白葉枯菌株中兩個新的IS1112插入位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)[A];科技創(chuàng)新與綠色植保——中國植物保護(hù)學(xué)會2006學(xué)術(shù)年會論文集[C];2006年

9 沈華;關(guān)崇芬;;蛋白酪氨酸激酶及TCR激活途徑[A];中國中醫(yī)研究院基礎(chǔ)理論研究所學(xué)術(shù)論文匯編[C];1997年

10 劉欣;李云;陳受宜;張勁松;哈達(dá);鄧文廣;張英志;;轉(zhuǎn)AhDREB1基因毛白楊的分子生物學(xué)鑒定及抗鹽性分析[A];全國作物生物技術(shù)與誘變技術(shù)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2005年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 本報記者 趙明;“淘寶”：誕生２月如何引資１億[N];中國經(jīng)濟(jì)時報;2003年

2 李帥;誰給了“老百姓”18億元[N];中國醫(yī)藥報;2005年

3 丁一嵐;《左麟右李》理性控制發(fā)行規(guī)模[N];中國電影報;2006年

4 趙媛媛 鄧興軍 張玉;早期教育的困惑[N];河北日報;2005年

5 陳曉東;中國游戲人才培養(yǎng)與世界接軌[N];經(jīng)濟(jì)參考報;2005年

6 本報記者趙雷;阿里巴巴　燒錢1億　[N];中華工商時報;2003年

7 本報記者 李妍 崔娜;《夜宴》《寶貝計(jì)劃》如何取得“雙贏”[N];中國電影報;2006年

8 吳鶴滬;聯(lián)和電影院線國慶市場分析[N];中國電影報;2005年

9 ;緊跟客戶是針打的取勝之道[N];中國計(jì)算機(jī)報;2003年

10 本報記者　 李石營;正則繡如秋月華[N];人民日報海外版;2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 陳興勇;中華眼鏡蛇細(xì)胞毒素基因克隆、表達(dá)及對腫瘤細(xì)胞作用機(jī)理的研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2009年

2 王穎;天然食品防腐劑人溶菌酶編碼基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

3 楊成濤;NifA蛋白的多聚功能及多拷貝nifA基因?qū)俎Ｖ腥A根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)固氮功效的促進(jìn)[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2003年

4 彭明利;結(jié)核桿菌HSP70及其與HBsAg融合蛋白在Pichia pastoris 酵母中的表達(dá)和免疫學(xué)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2002年

5 惠希武;重組人IFN-λ1的制備及其抗腫瘤活性的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年

6 黃宗堂;重組人FLT-3配體胞外區(qū)在畢赤氏酵母中的表達(dá)與鑒定[D];天津醫(yī)科大學(xué);2002年

7 謝云飛;IFN-λ1在嗜甲醇酵母中的表達(dá)、純化和活性測定以及其受體信號通路的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2005年

8 黃義德;外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)策略—人骨形態(tài)發(fā)生蛋白4和7的表達(dá)研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2008年

9 李三和;外源1Dx5、1Ax1基因在小麥品質(zhì)育種中的應(yīng)用研究[D];華中科技大學(xué);2007年

10 武志強(qiáng);穩(wěn)定表達(dá)長效胰高血糖素樣肽-1重組釀酒酵母的構(gòu)建及其應(yīng)用研究[D];南開大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 龔杰萬;mae和misgurin兩種基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其在畢赤酵母中的表達(dá)[D];暨南大學(xué);2002年

2 馬精彩;多拷貝水蛭素基因在畢赤酵母中的分泌型表達(dá)[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

3 楊棟;馬鈴薯Y病毒N株系HC-Pro基因在畢赤酵母中分泌表達(dá)與鑒定及抗血清制備[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2006年

4 陳曉麗;重組質(zhì)粒βhCG-pPIC9K的構(gòu)建及在酵母細(xì)胞中的表達(dá)[D];暨南大學(xué);2001年

5 王蓮哲;利用胞外表達(dá)SAM合成酶進(jìn)行酶促法合成S-腺苷甲硫氨酸的研究[D];華中科技大學(xué);2007年

6 唐鍵;重組人卵透明帶ZP3蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)和純化[D];暨南大學(xué);2004年

7 譚在高;多拷貝pilA基因功能暨水平轉(zhuǎn)移基因hdsp作用機(jī)制的初步研究[D];山東大學(xué);2011年

8 鄭育聲;重組人巨細(xì)胞病毒（HCMV）嵌合肽的構(gòu)建及其在畢赤酵母中的表達(dá)[D];暨南大學(xué);2002年

9 馬孟根;黑曲霉N25植酸酶phyA基因表達(dá)片段的克隆及pPIC9K重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

10 劉倜;多拷貝策略構(gòu)建瑞氏木霉外源基因系列表達(dá)載體[D];山東大學(xué);2005年

本文編號：2593656