【摘要】： MAE是本實驗室設計的具有抗菌活性的雜合肽，它是以MagaininⅡ(殘基4-14)和Melittin(殘基2-13)為親本，并對序列進行了優(yōu)化改造后設計出的雜合肽。本文對雜合肽的高級結構進行了模擬，得到了該雜合肽高級結構的初步信息。并以已構建的載體pTYB2-mae為模板，通過PCR擴增出融合基因mae-imein-cbd，將其克隆于表達質粒pPIC9K中，通過鑒定并測序正確后，電轉化真核表達宿主——畢赤酵母菌株GS115，通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選重組子，再利用G418抗性篩選出整合有多拷貝外源基因的重組子。按表達手冊進行表達實驗，挑選出具有高分泌表達水平的菌株，并采用不同的誘導時間、pH值、甲醇誘導濃度進行表達比較，優(yōu)化出適宜的表達條件。采用優(yōu)化的表達條件進行大量發(fā)酵，對上清液超濾濃縮脫鹽后，采用幾丁質基質進行親和層析分離目的蛋白，溴化氰切割，瓊脂孔穴法測抗菌活性。結果表明，純化后的產物具有明顯的抗菌活性。 Misgurin是一種從泥鰍中分離出來的，具有強抗菌活性而無溶血活性的抗菌肽，因而有望成為一種抗菌新藥。本文根據GENEBANK登錄的氨基酸序列，同時考慮構建和表達的需要，化學合成了misgurin基因和接頭，采用一種新的策略，在體外將基因多拷貝同向串連，并將其克隆于表達質粒pPIC9K中，通過鑒定并測序正確后，電轉化真核表達宿主——畢赤酵母菌株GS115，通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選重組子，再利用G418抗性篩選出整合有多拷貝外源基因的重組子。按表達手冊進行初步表達實驗，經SDS-PAGE檢測表明，酵母重組子分泌出了目的蛋白。
【圖文】：

n兩種基因表達載體的構建及其在畢赤酵母中的表達2.基因和接頭的連接基因和接頭最終連接產物2%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖18，，從圖中可以看出連接產物能形成明顯的一條條帶，且基因片段長能高達IKb以上，也即能獲得較高的拷貝數(20個拷貝左右)。出于MISGU刃N是陽離子多膚，過高的拷貝數會影響表達量[l“’]的考慮，我們只回收4個拷貝的串連基因。100b衛(wèi)—500bP—M:100bPladder1000bPLanel:連接產物圖18最終連接產物瓊脂糖凝膠電泳圖3.轉化子的PCR鑒定及測序連接產物轉化大腸桿菌受體菌DHS。，涂布在含Amp的抗性篩選LB平板上。設置的對照與預期相符，說明轉化過程正常。挑取20個轉化子

結果進一步的支持了關于抗菌膚是無受體介導的過程。“穿孔模型(barrel一stavemodel)”和“地毯模型(e抑etmodel)”是目前關于抗菌膚膜活性作用過程的兩種最常見的模式。它們的作用模式圖如圖3。圖3:抗菌膚的兩種作用模式，左邊為地毯模型，右邊為穿孔模型暨南大學碩十畢業(yè)論文
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：Q78

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本文編號：2593656