【摘要】：腫瘤壞死因子(TNF)是由3個分子量為17kDa亞單位組成的同源三聚體的可溶型蛋白質，主要由單核細胞和巨噬細胞產生。體內還存在分子量為26kDa的膜結合形式的TNF。TNF不僅是具有多方面免疫調節(jié)作用的細胞因子，而且通過刺激巨噬細胞、中性粒細胞和血管內皮細胞分泌多種細胞因子和介質，引起炎癥反應，導致組織的損傷。TNF的過量表達與感染性疾病、自身免疫性疾病以及腫瘤等多種疾病有關。在制定多種疾病生物學治療的策略中，TNF成為關鍵的靶位之一。 針對TNF的中和活性單克隆抗體在動物實驗中對內毒素和細菌引起的病理改變有明顯的阻斷作用。但鼠源性單抗在人體使用時，對人體具有免疫原性，可引起免疫反應，導致對抗體的清除，并引起免疫復合物介導的超敏反應。為了解決上述問題，建立了對鼠源性抗體改造的多種方法，如構建嵌合抗體或人源化抗體。在嵌合抗體構建過程中，最為重要的是篩選具有良好親和力及中和活性的鼠源性親本抗體，克隆其輕鏈和重鏈可變區(qū)基因。然后將可變區(qū)基因與人抗體恒定區(qū)基因連接，構建重組抗體基因。最后，將構建好的鼠-人嵌合基因導入真核細胞中，表達嵌合抗體。 第四軍醫(yī)大學碩士學位論又 臨床上用抗TNF嵌合抗體治療類風濕性關節(jié)炎和節(jié)段性腸炎取得 了良好的療效。美國FDA于1 998年和1 999年分別批準了用抗TNF 嵌合抗體治療節(jié)段性腸炎和類風濕性關節(jié)炎。因此，篩選出高親 和力及中和活性的鼠源單克隆抗體，克隆出其輕、重鏈可變區(qū)基 因，對構建高質量的嵌合抗體具有重要的意義。 我室制備了一組抗人TNF單抗，根據(jù)其效價及其與天然TNF 的結合特性，從中選擇了三株雜交瘤細胞，分別命名為D2、E6和 F6，，按常規(guī)方法制備腹水。腹水經(jīng)硫酸按沉淀后，分別用陰離子 交換層析法和蛋白A親和層析法對其進行了純化，抗體純度用 SDS一PAGE鑒定。D2、E6和F6三株單抗的純度分別達到91%、93% 和94%。高純度抗體是親和力和中和活性鑒定的重要保證。 親和力是治療用單抗的重要指標之一。高親和力的單抗所需 劑量低，可大大降低治療成本，減輕過敏反應。用間接EL工SA法 測定腹水和純化單抗的效價表明，三株單抗的效價較高，D2、E6 和F6腹水效價分別為lxlo一6、lxlo一7和lx10一7，純化抗體效價 分別為10ng/ml、2 ng/ml和2 ng/ml。 中和活性指單抗可阻斷TNF與其受體的結合，是治療用抗人 TNF單抗最為主要的參數(shù)。依據(jù)TNF參與炎性病理損傷的主要機 制，采用單抗抑制TNF誘導的L929細胞凋亡，單抗抑制T鄧上調 ECV3O4細胞ICAMd的表達，以及單抗抑制TNF誘導NF一B的核 轉位等三個實驗系統(tǒng)，分別在誘導凋亡、勃附分子表達和轉錄因 子活化和轉位等不同水平系統(tǒng)鑒定所選三株單抗的中和活性。結 果表明，三株單抗對TNF誘導的L929細胞凋亡的抑制作用有劑量 依賴關系，濃度為0.16、0.40和0.40件g/ml的DZ、E6和F6單 抗，可保護ZOU/ml TNF誘導的L929細胞半數(shù)不發(fā)生凋亡。在單 抗抑制TNF上調ECV304細胞ICAM一1表達的實驗中，其抑制作用 也呈良好的劑量依賴關系，1.0瑰/ml的D2、E6和F6單抗，對 ZOOU/ml TNF使ECv304細胞上ICAM一表達上調的抑制率，分別 第四軍醫(yī)大學碩士學位論文 為75.2%、64.3%和61.3%;三株單抗的濃度降到0.1魄/ml時， 抑制率仍可達到63.5%、57.0%和61.2%。在單抗抑制TNF誘導NF- KB核轉位的實驗中，預先用不同濃度的三株單抗分別與TNF孵 育后，加入至ECv3O4細胞培養(yǎng)液中。刺激lh后，收獲細胞，制 備細胞核提取液，用凝膠遷移實驗(eleetrophoresis mobility shift aSSay，EMSA)測定核提取液中NF一B的活性。結果表明， 三株單抗均可抑制TNF誘導NF一B核轉位，抑制作用與加入的中 和活性單抗呈良好的劑量依賴關系。濃度為10“g/m1DZ、E6和 F6單抗的抑制率分別為94.2%、64.9%和70.3%。三株單抗?jié)舛葹?0.1抖g/m1時，抑制率分別為75.1%、25.6%和49.5%。上述3種 實驗系統(tǒng)的鑒定結果表明，三株抗體均具有良好的中和活性，可 作為構建對自身免疫性疾病等有治療作用的嵌合抗體的侯選親本 單抗。 在系統(tǒng)鑒定了三株單抗的效價和中和活性的基礎上，選用D2 和F6雜交瘤細胞株，利用RT一PCR方法擴增可變區(qū)基因。將擴增 產物插入T載體，克隆出輕、重鏈可變區(qū)基因。測序得到其核昔 酸序列及其編碼的氨基酸序列，經(jīng)同源性分析，在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中 沒有發(fā)現(xiàn)完全一致的核普酸和氨基酸序列。獲得的序列符合抗體 可變區(qū)基因的特點，為功能性抗體的可變區(qū)基因。該基因序列在 構建對炎癥、自身免疫性疾病等有治療作用的嵌合抗體等方面有 巨大的潛在應用價值。 生物信息、學(bioinformatics)是應用信息學技術大規(guī)模的 分析、處理和研究大分子的一門科學。借助生物信息學的研究成 果，利用蛋白質間相互作用的模件，模擬TNF與單克隆抗體的相 互作用，精確計算各種相互作用力，定位抗體識別的表位。發(fā)現(xiàn) F6單抗與TNF的親和力(一299.92kcal)接近陽性對照(美國FDA 批準臨床使用的cAZ單抗)的水平(一302.29keal)，其結合 TNF 的表位也比較好。D2的親和力稍低(一252.69kcal)，但其結合的 第四軍醫(yī)大學碩士學位論又 TNF表位十分理想。E6的親和力相
【圖文】：

分別采用不同的方法純化不同亞類的抗體。2.2.1采用蛋白A親和層析法純化D2單抗(亞類為IgGZb)(圖2)。圖2蛋白A親和層析法純化D2單抗(IgGZb)

QFF陰離子交換層析法純化E6(工gGI)
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392

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本文編號：2589551