發(fā)布時(shí)間：2020-03-09 10:40

【摘要】：重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis,MG)是抗乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor,AchR)抗體介導(dǎo)的器官特異性自身免疫病。MG患者血清中多數(shù)抗AchR抗體針對(duì)的是α亞單位上的主要免疫原區(qū)(main immunogenic region,MIR)。當(dāng)致病性抗體同時(shí)與相鄰兩個(gè)AchR上的α亞單位相結(jié)合后,可以加速AchR的內(nèi)質(zhì)化作用;同時(shí),抗體可結(jié)晶片段可以激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑,造成AchR的損傷。由抗AchR抗體制備的單鏈抗體(single chain variable fragment,ScFv)作為單價(jià)片段,不會(huì)與AchR交叉結(jié)合,又能避免激活補(bǔ)體;同時(shí),ScFv與AchR α亞單位MIR結(jié)合后,可以特異性地封閉抗AchR抗體的結(jié)合位點(diǎn),從而對(duì)AchR起到保護(hù)作用。 本實(shí)驗(yàn)將鼠源性ScFvA7基因克隆至原核表達(dá)載體pHEN2上,并將成功構(gòu)建的pHEN2-ScFvA7轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E. coliHB2151中,使其在外周質(zhì)中表達(dá)。之后,通過(guò)鼠抗c-myc單克隆抗體(mAb)進(jìn)行斑點(diǎn)雜交試驗(yàn),對(duì)冷硼酸鈉裂解后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),以判定是否有目的蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步采用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡(western blotting)試驗(yàn)確認(rèn)表達(dá)產(chǎn)物的分子量。經(jīng)檢測(cè)得知,E. coliHB2151外周質(zhì)中有目的蛋白的表達(dá),而培養(yǎng)液上清及對(duì)照大腸桿菌外周質(zhì)和培養(yǎng)液上清均未發(fā)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)。在SDS-PAGE和蛋白印跡試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一條分子量約為36KD的單一帶,與理論估計(jì)值30.4KD相一致。ScFvA7蛋白在大腸桿菌中的成功表達(dá),為以后的單鏈抗體對(duì)重癥肌無(wú)力和基因治療準(zhǔn)備了材料。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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2 楊康鵑,孟繁平;免疫印跡法測(cè)定乙酰膽堿受體單克隆抗體的精細(xì)特異性[J];延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào);1998年04期

3 孟繁平,楊康鵑,Ｒ．Ａａｒｔｓ,Ｍ．ｄｅＢａｅｔｓ;乙酰膽堿受體單鏈?zhǔn)删w抗體的篩選與鑒定[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1997年01期

4 郝志波;郭晨云;蘧艷峰;袁靜明;;基因疫苗pcDNA-AChR_(α211)免疫小鼠建立重癥肌無(wú)力動(dòng)物模型[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2006年03期

5 楊康鵑,孟繁平,YGraus,MdeBaets;重癥肌無(wú)力自身抗體的特異性和序列分析[J];中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志;1997年02期

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3 范華英;重癥肌無(wú)力抗乙酰膽堿受體單鏈抗體與人血清白蛋白融合基因的構(gòu)建和表達(dá)[D];延邊大學(xué);2004年

4 周禮圓;重癥肌無(wú)力T淋巴細(xì)胞端粒酶活性的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2006年

5 景少巍;重癥肌無(wú)力患者抗乙酰膽堿受體抗體的測(cè)定及意義[D];延邊大學(xué);2007年

6 韓曉敏;重癥肌無(wú)力單鏈抗體A7在畢赤酵母中的表達(dá)及檢測(cè)[D];延邊大學(xué);2007年

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本文編號(hào)：2585804