【摘要】： 間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的成體干細胞。在一定的體內外誘導條件下，MSCs能向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、星形膠質細胞和神經原細胞分化。研究表明MSCs具有弱免疫原性和很強的免疫調節(jié)功能。這些生物學特性使其在組織工程、基因治療、細胞移植等領域具有廣闊的應用前景。骨髓是MSCs最為豐富，也是最可靠的來源。最近的研究表明外周血中亦存在MSCs，與骨髓穿刺取材相比，外周血MSCs采集方便且它們的生物學特性和骨髓MSCs相似：擁有多向分化能力，可遷入骨髓支持造血，還可遷入全身多種組織并在其中穩(wěn)定表達外源治療基因。隨著研究的深入，外周血MSCs將會在組織工程、造血重建、遺傳病和腫瘤基因治療等領域和骨髓MSCs一樣被廣泛的應用。 作為MSCs鑒定的重要組成部分，其特異性的表面標記一直以來都是人們研究的熱點，但至今尚未有突破性的進展。通過單克隆抗體的篩選制備來尋找特異性表面分子是近年來開展的前沿技術。20世紀90年代以來研究者通過雜交瘤技術制備了多株人MSCs相關的單克隆抗體，目前較為特異性的有SH2、SH3、SH4、STRO-1、Thy1等，但這些單克隆抗體均與其他細胞存在交叉反應，故至今尚無人MSCs單一的特異性表面標記。在MSCs的研究中仍需要通過多個表面分子聯合標記結合自我更新和多向分化潛能的特性對其進行鑒定，這給MSCs的檢測和分選帶來一定難度。因此，制備特異性MSCs表面分子的單克隆抗體并應用于骨髓及外周血MSCs的檢測對于MSCs的研究具有重要意義。 本課題組應用雜交瘤技術，以人骨髓MSCs免疫小鼠，獲得了穩(wěn)定分泌抗人骨髓MSCs抗體的細胞株，將其分泌的抗體命名為ZUB1。本研究旨在大量制備單克隆抗體ZUB1，同時對其進行純化及鑒定，并以此為探針應用于流式細胞術檢測MSCs，為MSCs的生物學功能研究和臨床應用提供有效的工具。 本研究將抗人骨髓MSCs單克隆抗體ZUB1雜交瘤細胞注射到經石蠟油預處理的BALB/C小鼠腹腔，誘生腹水，每只小鼠接種1.0×10~6細胞，兩周左右后收集腹水，即可獲得大量單克隆抗體。以間接免疫熒光染色法測腹水效價為1：10~4，用鹽析法粗提單克隆抗體，再用離子交換法純化單克隆抗體。經間接免疫熒光染色法將單克隆抗體ZUB1分別與人骨髓來源的細胞株HL-60、NB4、K562、U937、HEL、Jurkat、Raji作交叉反應，結果未見交叉反應，同時以免疫組織化學法檢測了12個間充質和非間充質來源的組織標本(骨髓、韌帶、肌腱、神經、脂肪、肌肉、血管壁、表皮、肺、肝、小腸、膽囊)，除骨髓組織外均未見交叉反應。采用間接免疫熒光染色法檢測抗人骨髓MSCs單克隆抗體ZUB1與大鼠、犬的骨髓MSCs無交叉反應。以上研究表明ZUB1能與人MSCs特異性結合，這是ZUB1用于MSCs檢測的前提。 分別以CD105及ZUB1為探針，流式細胞術檢測體外培養(yǎng)的骨髓MSCs的陽性率分別為(97.00±1.41)％和(97.60±1.15)％。以CD105-APC、CD34-PE、CD45-PEcy5.5、GlyA-PE單克隆抗體聯合標記及ZUB1-FITC、CD34-PE、CD45-PEcy5.5、GlyA-PE單克隆抗體聯合標記采用多色流式細胞術檢測CD105+CD34-CD45-GlyA-正常人外周血間充質干細胞及ZUB1+CD34-CD45-GlyA-正常人外周血MSCs，初步建立了外周血MSCs的檢測方法。在相同的實驗條件下，取同一份靜脈血標本由同一個操作者重復三次，觀察結果的變異度，發(fā)現變異度較小，說明該實驗具有可重復性。本研究采集了22例健康供者外周血，檢測其中CD105+CD34-CD45-GlyA-及ZUB1+CD34-CD45-GlyA-外周血MSCs的含量，初步建立人外周血間充質干細胞流式細胞術檢測標準。ZUB1+CD34-CD45-GlyA-外周血MSCs在外周血單個核細胞中的含量為(0.161±0.108)％，CD105+CD34-CD45-GlyA-外周血MSCs在外周血單個核細胞中的含量為(0.037±0.023)％，，性別相關性無統計學意義。 綜上所述，本研究得出以下結果： 1．本課題組制備并純化的抗人骨髓間充質干細胞單克隆抗體ZUB1能與人間充質干細胞特異性結合。 2．單克隆抗體ZUB1-FITC熒光抗體可用于檢測體外培養(yǎng)人間充質干細胞。 3．初步建立了多色流式細胞術檢測CD105+CD34-CD45-GlyA-和ZUB1+CD34-CD45-GlyA-正常人外周血間充質干細胞的方法，并證明該方法是可重復的。 4．初步建立了多色流式細胞術檢測CD105+CD34-CD45-GlyA-和ZUB1+CD34-CD45-GlyA-正常人外周血間充質干細胞的標準。
【圖文】：

胞開始分裂增殖，部分區(qū)域形成細胞團簇，成集落樣分布，細胞呈梭形外觀。2周后細胞融合成單層，梭形突起變長，排列有明顯方向性，呈漩渦狀、網狀、輻射狀(見圖2)。細胞經傳代培養(yǎng)后， 12h完全貼壁，重新變成梭形細胞。細胞傳代后生長迅速，增殖快，大約7d左右達完全融合，與原代細胞形態(tài)基本一致。圖2原代培養(yǎng)骨髓 MSCs(14d)X100

100101102CD166CD16692.8%103104100101102103104CD吟4CD4497.3%圖3骨髓MSCS表型流式細胞術檢測結果1.4單克隆抗體的ZUBI的鑒定1.4.1單克隆抗體ZUBI效價的鑒定間接免疫熒光染色法檢測抗體效價，免疫熒光顯微鏡卜觀察活染的MSCS，ZUBI與MSCS特異性結合，與熒光二抗結合后細胞表面顯示特異性的綠色熒光。觀察發(fā)現從第5孔開始熒光消失，抗體效價即為1:10‘。1.4.2單克隆抗體ZUBI在不同來源細胞中的表達經間接免疫熒光染色法檢測ZUBI與骨髓來源的細胞株HL一60、NB4、K562、U937、IIEL、丁urkat、Roji均無交叉反應(圖4)。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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本文編號：2584478