【摘要】： 陰道毛滴蟲屬單細(xì)胞寄生性原生動(dòng)物，在分類上屬肉鞭門鞭毛亞門的動(dòng)鞭毛綱，毛滴蟲目，毛滴蟲科，毛滴蟲屬，人是它唯一的寄主。陰道毛滴蟲引發(fā)的滴蟲性陰道炎(trichomoniasis)是世界上最常見的性傳播疾病(STD，sexually transmitted disease)之一。 陰道毛滴蟲的基因組約為160Mb，且至少65％為重復(fù)序列，為了完成其全基因組的測(cè)序和組裝，繪制一張高精度的物理圖譜尤為重要。本研究以陰道毛滴蟲的EST數(shù)據(jù)、基因組WGS測(cè)序數(shù)據(jù)和Fosmid文庫(kù)為基礎(chǔ)，利用STSpooling的方法初步繪制了陰道毛滴蟲的物理圖譜。通過(guò)生物信息學(xué)的詳細(xì)分析，實(shí)驗(yàn)在候選的STSs中共設(shè)計(jì)了1353對(duì)PCR引物，篩選了基因組Fosmid文庫(kù)中46個(gè)superpools共17664個(gè)克隆，最后參與物理圖譜拼接的有810個(gè)STSs和2555個(gè)克隆。拼接得到382個(gè)contigs和102個(gè)singlets，總長(zhǎng)度為21.9Mb，基因組覆蓋率約為12.5％。最長(zhǎng)的congtig是由26個(gè)STSs定位在119個(gè)clones上得到的，長(zhǎng)度約為410.2kb。 由于陰道毛滴蟲的基因組比項(xiàng)目開始時(shí)預(yù)期的20Mb左右要大出近8倍，因此用插入片斷較小、基因組覆蓋度低的Fosmid文庫(kù)很難繪制高質(zhì)量的物理圖譜，進(jìn)而我們嘗試構(gòu)建平均插入片段大于100kb的基因組BAC文庫(kù)，并利用其構(gòu)建高精度的物理圖譜。通過(guò)對(duì)陰道毛滴蟲基因組BAC文庫(kù)構(gòu)建試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)：陰道毛滴蟲含有較多內(nèi)源性核酸酶(nuclease)，為了避免其降解DNA，需在制備瓊脂糖包埋塊時(shí)加入濃度為1.5％的DEPC，才得較好的抑制核酸酶的活性。通過(guò)測(cè)驗(yàn)BamHⅠ，EcoRⅠ，HindⅢ和MboⅠ四種限制性內(nèi)切酶對(duì)陰道毛滴蟲基因組的酶切情況，發(fā)現(xiàn)MboⅠ的酶切位點(diǎn)較多，隨機(jī)性比較好，適宜作為MboⅠ作為部分酶切的限制性內(nèi)切酶。同時(shí)還對(duì)部分酶切的條件進(jìn)行了研究，確定0.08U／plug MboⅠ，37℃，60min為最佳部分酶切條件。此外還研究了1.8Kv和2.1Kv兩個(gè)條件下的電轉(zhuǎn)化情況，，發(fā)現(xiàn)高電壓2.1Kv時(shí)更有利于小片斷的轉(zhuǎn)入；而低電壓1.8Kv時(shí)更有利于大片斷的轉(zhuǎn)入，但轉(zhuǎn)化效率較高電壓有所降低。
【圖文】：

陰道毛滴蟲簡(jiǎn)介陰道毛滴蟲是Donne于 1836年從膿性陰道分泌物和男性泌尿生殖道分泌物中首次發(fā)現(xiàn)的，1916年被確認(rèn)為婦女滴蟲性陰道炎的病原體(圖1.1)。1957年發(fā)現(xiàn)了有效的治療藥物甲硝哇(metronidazole)， 1962年臨床首次報(bào)道陰道毛滴蟲對(duì)甲硝哇具抗藥性。其引發(fā)的滴蟲性陰道炎(trichomoniasis)是世界上最常見的性傳播疾病(sTD， sexuallytransmitteddisease)之一，目前全世界每年有 170，000，000感染者【’]。研究還表明滴蟲性陰道炎患者HW的感染率是正常人的6倍，與Hlv的傳播有相當(dāng)?shù)年P(guān)聯(lián)性[2]。陰道毛滴蟲作為一種性傳播疾病病原體越來(lái)越受到人們的重視。、價(jià)豁灸/troPhozoite(勿P刀嘰PaPPa，ands·M.W.rdr0P)圖1.1陰道毛滴蟲A:電鏡照片B:模式圖 AF:anteriorflagella(前鞭毛);RF:reeurrentfl眼ella(后鞭毛);AX:axostyle(軸桿);eo:eosta(肋);HY:hydrogenosome(氫化酶體);N:nueleus(細(xì)胞核 );pB:parabasalbody(副基體 );pG:parabasalbodyandGolgi即paratus(副基體和高爾基體)陰道毛滴蟲屬單細(xì)胞寄生性原生動(dòng)物

BAC文庫(kù)的原始材料。smid基因組文庫(kù)庫(kù)有48個(gè)超級(jí)池，每個(gè)超級(jí)池代表384個(gè)克隆�？寺〉钠綖�35.2kb。為了實(shí)驗(yàn)方便，篩庫(kù)的時(shí)候使用了46個(gè)超級(jí)池。腸桿菌菌株及BAC載體oliTransforMaxEPI300[F一mcrAA(mrr一hsdRMS一mcrBC)eZAM15△laeX74recAIenJAIaraD139△(ara，leu)7697galUgaGtrjA咖frl，購(gòu)自即icentre公司，用作BAc文庫(kù)構(gòu)建的宿主e載體eopyeontrolpeCIBAe(BamHI)試劑盒購(gòu)自Epieentre公見圖2.1。該載體構(gòu)建的BAc文庫(kù)克隆可在加入copycontrol誘ntre)時(shí)在丑coliTransforMaxEpI3oo中由1一2拷貝/細(xì)胞轉(zhuǎn)換成[58一。ECo只!332
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R383

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2579346