【摘要】： 中華按蚊(Anopheles sinensis)和雷氏按蚊(An. lesteri)(原嗜人按蚊An. anthropophagus)是我國(guó)分布廣且常見(jiàn)的蚊種,是其分布區(qū)瘧疾的重要傳播媒介,實(shí)施有效的蚊媒防制手段是瘧疾控制的重要環(huán)節(jié),而蚊媒的生物學(xué)特性是制定防制策略的基礎(chǔ)。本研究擬構(gòu)建中華按蚊和嗜人按蚊的微衛(wèi)星DNA庫(kù),并篩選其中多態(tài)的微衛(wèi)星位點(diǎn),其微衛(wèi)星DNA序列庫(kù)可為按蚊基因組學(xué)研究積累基礎(chǔ)資料;多態(tài)的微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)將為中華按蚊和雷氏按蚊的基因定位、群體遺傳結(jié)構(gòu)和生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域的研究提供新的分子標(biāo)志。 本研究應(yīng)用基因組DNA的酶切片段與生物素標(biāo)記的(AAT)17,(GA)25,(CCT)17,(AC)25,(CAG)17,(CA)18,(CAC)5,(TC)10,(GT)8和(TG)18等寡核苷酸探針雜交,結(jié)合親合素富集和超濾離心濃縮,首先將基因組DNA中含微衛(wèi)星DNA的片段富集,經(jīng)3次PCR擴(kuò)增放大后,插入T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli),篩選含微衛(wèi)星DNA序列的陽(yáng)性克隆,測(cè)定分析其序列,完成中華按蚊和雷氏按蚊微衛(wèi)星DNA庫(kù)的構(gòu)建。在構(gòu)建中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫(kù)的基礎(chǔ)上,挑選合適的微衛(wèi)星位點(diǎn),設(shè)計(jì)、合成引物,建立各微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增體系。應(yīng)用經(jīng)分子鑒別的中華按蚊現(xiàn)場(chǎng)樣本,聚丙烯酰氨凝膠電泳和基因掃描篩選具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。 本研究獲得的結(jié)果如下: 1.構(gòu)建的中華按蚊微衛(wèi)星DNA序列庫(kù)中包含282條序列,其中9條序列完全相同,故獨(dú)立的微衛(wèi)星DNA序列共273條。 2.本研究的中華按蚊微衛(wèi)星DNA序列庫(kù)中雙核苷酸重復(fù)最為常見(jiàn),三核苷酸重復(fù)次之,多核苷酸重復(fù)少見(jiàn),其中以(CA)n和(GT)n的微衛(wèi)星DNA序列含量最為豐富,重復(fù)次數(shù)最多的可達(dá)54次。其中完整的微衛(wèi)星DNA序列89個(gè),占32.6%;非完整的序列82個(gè),占30.1%;其余為復(fù)合序列,占37.3%。 3.筆者在構(gòu)建的中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫(kù)中,選取了22條適當(dāng)?shù)男蛄?設(shè)計(jì)、合成引物,建立了PCR擴(kuò)增體系,結(jié)果顯示其中15對(duì)引物有特異擴(kuò)增條帶。 4.經(jīng)過(guò)對(duì)現(xiàn)場(chǎng)樣本的分子鑒別,選用確認(rèn)的中華按蚊4個(gè)群體的40個(gè)樣本,PCR擴(kuò)增各微衛(wèi)星位點(diǎn),檢測(cè)結(jié)果顯示有10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)存在多態(tài)性,即:AS5,AS6,AS9,AS13,AS14,AS15,AS16,AS22,AS31和AS43。 5.本研究分離獲得61條雷氏按蚊的微衛(wèi)星DNA序列,其中獨(dú)立的序列共60條。
【圖文】：

第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文司，四色熒光標(biāo)記的雙脫氧鏈終止法測(cè)序，常用 T 載體上通用引物（如：M13+）。2．12 序列分析方法測(cè)序結(jié)果以 Chromas 軟件進(jìn)行核對(duì)，必要時(shí)采用 Clustal X 進(jìn)行源性和差異性采用 Bioedit 和 Mega 軟件整理和分析。3 結(jié)果與討論3．1 酶切基因組 DNA、膠回收酶切片段M1 - 1 2 3 M2

圖 1－2 中華按蚊基因組 DNA 酶切片段連接產(chǎn)物 P泳道 1－4：連接產(chǎn)物的 PCR 產(chǎn)物；M：DN連接有 SAU 接頭的膠回收 DNA 片段作為 PCR 反應(yīng)模物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，，擴(kuò)增產(chǎn)物片段應(yīng)集中在 200 - 900 b與酶切基因組 DNA 后收集的的片段應(yīng)大小一致，提示效的。3 PCR 富集微衛(wèi)星 DNA
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R384

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2573166