本文關(guān)鍵詞：硒蛋白K對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：硒是一種人類(lèi)和動(dòng)物必需的微量元素,與許多疾病密切相關(guān),如癌癥、神經(jīng)退行性疾病及心血管病等,并在一些重大疾病的防治中起到重要作用。硒在生物體內(nèi)主要以遺傳密碼子UGA編碼的第21種氨基酸--硒代半胱氨酸(Sec)的形式存在于蛋白質(zhì)內(nèi),通過(guò)各種硒蛋白發(fā)揮生物功能。目前在人類(lèi)基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了25種硒蛋白,但研究較清楚的僅有谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等少數(shù)硒蛋白。硒蛋白K(Sel K)是2003年被Gladyshv實(shí)驗(yàn)室鑒定出的一種新型硒蛋白,發(fā)現(xiàn)早期關(guān)于Sel K的生物學(xué)功能一直研究甚少,直到近幾年才有了一些研究進(jìn)展。研究表明Sel K可能有如下功能:Sel K在心肌細(xì)胞中參與應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激;在人肝癌細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解;參與免疫調(diào)節(jié);參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表面CD36棕櫚�；�,影響泡沫細(xì)胞的形成和動(dòng)脈粥樣化。探究Sel K生物學(xué)功能、了解Sel K與疾病的關(guān)系具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。蛋白質(zhì)的組織差異表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位與其生物學(xué)功能存在一定的相關(guān)性。為了解Sel K在哺乳動(dòng)物各組織中的差異表達(dá)情況,本研究采用BALB/c小鼠作為研究對(duì)象,取新鮮組織脾臟、腎臟、腸、肺、腦和肝臟,通過(guò)Real time-PCR和Western blot分別檢測(cè)Sel K在m RNA和蛋白水平上的組織差異表達(dá)情況,結(jié)果顯示Sel K在脾臟中的表達(dá)明顯高于其他組織。制作小鼠脾臟組織的石蠟切片,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色的方法,驗(yàn)證了Sel K在脾臟中的高表達(dá),并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出Sel K圍繞在細(xì)胞核周?chē)�。采用�?xì)胞免疫熒光的方法進(jìn)一步研究Sel K在小鼠T淋巴細(xì)胞內(nèi)的位置,用Alexa Fluor#174;488綠色熒光標(biāo)記KDEL(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記物),同時(shí)用TRITC紅色熒光標(biāo)記Sel K,結(jié)果顯示這兩種熒光重合,因此表明Sel K與KDEL定位在同一位置即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。為進(jìn)一步研究Sel K在細(xì)胞免疫中所起的作用,本研究構(gòu)建了用于干擾Sel K表達(dá)的干擾載體(p GPU-Sel K-mus-222、p GPU-Sel K-mus-102和p GPU-Sel K-mus-101),成功轉(zhuǎn)染小鼠T淋巴細(xì)胞,選擇干擾效率最佳的p GPU-Sel K-mus-101載體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CD3體外激活干擾組和對(duì)照組T細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)與增殖分化相關(guān)的指標(biāo)變化(Ca~(2+)、IL-2Rα、IL-4)。結(jié)果表明激活后的干擾組T細(xì)胞中鈣離子濃度上升趨勢(shì)較弱與對(duì)照組有顯著性差異,即說(shuō)明Sel K的減少影響了細(xì)胞活化過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度的升高,進(jìn)一步研究表明Sel K干擾對(duì)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)蛋白(CHERP)的表達(dá)有抑制作用,說(shuō)明Sel K有可能通過(guò)CHERP來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞活化過(guò)程中的鈣流。采用Real time-PCR檢測(cè)IL-2Rα的表達(dá)情況,結(jié)果顯示激活后的對(duì)照組細(xì)胞中IL-2Rα的m RNA水平顯著上升,而激活前后的干擾組細(xì)胞中IL-2Rα的m RNA水平無(wú)顯著變化,同樣說(shuō)明Sel K的減少影響了細(xì)胞活化過(guò)程中IL-2Rα的表達(dá)。采用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物上清中細(xì)胞因子(IL-4)的分泌情況,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,干擾組細(xì)胞上清液中IL-4的分泌顯著下降。這些結(jié)果表明Sel K可能在TCR活化誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖分化過(guò)程具有重要的作用。硒代蛋氨酸常用來(lái)體外處理細(xì)胞以達(dá)到補(bǔ)硒的效果,我們用不同濃度(1μM,3μM,5μM,10μM,50μM,100μM)的硒代蛋氨酸體外處理T淋巴細(xì)胞,CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)硒代蛋氨酸對(duì)T淋巴細(xì)胞變現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象,5μM硒代蛋氨酸處理T淋巴細(xì)胞24小時(shí)可以表現(xiàn)出最佳的增殖效果。Real time-PCR檢測(cè)硒代蛋氨酸對(duì)T淋巴細(xì)胞內(nèi)Sel K表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)加硒處理組細(xì)胞中Sel K的表達(dá)顯著升高,以上結(jié)果提示適量補(bǔ)硒會(huì)提高Sel K的表達(dá)并且促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖,或因此提高機(jī)體免疫能力。以上結(jié)果表明Sel K是一種在脾臟高表達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白,Sel K干擾抑制了CHERP的表達(dá),或因此影響到細(xì)胞活化過(guò)程中的鈣離子濃度的升高,從而阻礙了下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),如IL-2Rα的表達(dá)、IL-4的分泌等。此外適量濃度的硒代蛋氨酸可以提高T淋巴細(xì)胞中Sel K的表達(dá),并且可以促進(jìn)細(xì)胞增殖,或因此提高機(jī)體免疫能力。
【關(guān)鍵詞】：硒蛋白K T淋巴細(xì)胞 體外干擾 免疫應(yīng)答 硒代蛋氨酸
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-21
• 1.1 硒與硒蛋白12-16
• 1.1.1 硒12
• 1.1.2 硒蛋白12-16
• 1.2 SelK16-19
• 1.2.1 SelK的結(jié)構(gòu)特征16
• 1.2.2 SelK的細(xì)胞內(nèi)定位與組織分布16-17
• 1.2.3 SelK的生物學(xué)功能研究進(jìn)展17-19
• 1.3 T細(xì)胞活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑19-20
• 1.4 RNA干擾技術(shù)20
• 1.5 論文的選題與意義20-21
• 第2章 材料與方法21-45
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-26
• 2.1.1 小鼠21
• 2.1.2 細(xì)胞株21
• 2.1.3 大腸桿菌菌株21
• 2.1.4 質(zhì)粒21-22
• 2.1.5 引物22
• 2.1.6 主要試劑和試劑盒22-24
• 2.1.7 實(shí)驗(yàn)主要試劑的配制24-25
• 2.1.8 實(shí)驗(yàn)主要儀器25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-45
• 2.2.1 Real time-PCR檢測(cè)SelK、IL-2Rα 和CHERP基因在mRNA水平上的表達(dá)26-29
• 2.2.2 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平29-32
• 2.2.3 免疫組化檢測(cè)各組織中Sel K的表達(dá)與分布32-35
• 2.2.4 T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)35-36
• 2.2.5 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)Sel K在T淋巴細(xì)胞中的定位36-37
• 2.2.6 shRNA載體的構(gòu)建與鑒定37-41
• 2.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染41-43
• 2.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鈣流43
• 2.2.9 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子43-44
• 2.2.10 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況44-45
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-64
• 3.1 SelK在小鼠中的組織分布45-48
• 3.1.1 SelK在小鼠組織中mRNA水平上的差異45-47
• 3.1.2 SelK在小鼠各組織中蛋白水平上的表達(dá)差異47-48
• 3.2 SelK的細(xì)胞內(nèi)定位48-49
• 3.2.1 免疫組化檢測(cè)Sel K在小鼠脾臟中的分布48-49
• 3.2.2 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果49
• 3.3 干擾質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定49-50
• 3.3.1 干擾質(zhì)粒的雙酶切鑒定49-50
• 3.3.2 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定結(jié)果50
• 3.4 體外干擾Sel K對(duì)T淋巴細(xì)胞的影響50-61
• 3.4.1 shRNA體外干擾小鼠T淋巴細(xì)胞SelK的表達(dá)50-53
• 3.4.2 SelK干擾對(duì)T淋巴細(xì)胞中鈣流的影響53-56
• 3.4.3 SelK干擾對(duì)細(xì)胞內(nèi)CHERP的影響56-57
• 3.4.4 SelK干擾對(duì)細(xì)胞內(nèi)IL-2R的影響57-59
• 3.4.5 SelK缺乏對(duì)T淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子的影響59-61
• 3.5 體外加硒對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖以及SelK表達(dá)的影響61-64
• 3.5.1 硒代蛋氨酸對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響61-62
• 3.5.2 硒代蛋氨酸對(duì)T淋巴細(xì)胞中SelK表達(dá)的影響62-64
• 第4章 討論64-67
• 第5章 結(jié)論67-68
• 參考文獻(xiàn)68-73
• 附錄73-77
• 致謝77-78
• 攻讀碩士期間的研究成果78-79

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 田金可;吳秋玨;王恬;;硒的抗氧化功能及在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J];中國(guó)飼料;2011年23期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 李靜;基因工程方法構(gòu)建高GPx活性的含硒抗氧化酶[D];吉林大學(xué);2008年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 趙斌;硒對(duì)大豆生理生化與產(chǎn)質(zhì)量影響的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

  本文關(guān)鍵詞：硒蛋白K對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答影響的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：257296