【摘要】： 目的人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus，RSV)廣泛流行于世界各地，是嬰幼兒下呼吸道感染的最重要病原。目前尚無安全、有效的疫苗用于預防RSV感染。RSV兩個重要的糖蛋白膜表面表達的融合蛋白F(fusion protein，F(xiàn))和粘附蛋白G，是激發(fā)機體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白，也是疫苗研究發(fā)展的重要內(nèi)容。與G蛋白相比，F(xiàn)蛋白有更多的抗原識別位點，不同亞型間F蛋白高度保守、同源性高達86％，能刺激機體產(chǎn)生體液免疫及細胞免疫應答，針對F的中和抗體具有交叉保護作用，，是RSV疫苗研究的最重要的靶抗原。輔助病毒依賴型腺病毒載體(helper-dependent adenoviral vector，HDAd)主要用于基因治療研究，作為疫苗載體的研究起步較晚，尚沒有作為黏膜基因釋放系統(tǒng)用于疫苗研究的報道。HDAd與腺病毒具有相同的細胞嗜性，對呼吸道上皮細胞具有高效感染的能力，且能長期、持續(xù)表達轉(zhuǎn)基因，具有重要的研究與使用價值。本研究擬構建可表達A亞型RSV F蛋白的輔助病毒依賴型腺病毒載體(HDAd／F)，并完成大量制備、純化和F蛋白的體外表達鑒定，為進一步的體內(nèi)免疫效果和免疫保護作用研究奠定基礎。 方法將帶有CMV啟動子序列的F基因亞克隆至克隆載體pSC11，鑒定正確后，克隆至HDAd質(zhì)粒pSC15B，構建pSC15B／F HDAd重組質(zhì)粒，PmeⅠ消化pSC15B／F去除原核復制元件及抗性基因，獲得HDAd／F DNA分子，經(jīng)磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293Cre4細胞，16 h后感染輔助病毒，收獲HDAd／F載體粗提液，隨后以HDAd／F粗提液及輔助病毒連續(xù)共感染293Cre4細胞直至HDAd／F達到復制極限，同時以可表達β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，LacZ)報告基因的HDAdLacZ載體作為平行對照監(jiān)測載體復制過程。大量制備HDAd／F，CsCl密度梯度及等密度梯度兩次超速離心純化，利用分子生物學技術體外鑒定HDAd／F表達情況。 結果成功構建了可表達RSV F蛋白的HDAd／F載體，通過與輔助病毒共感染293Cre4細胞及CsCl梯度法超速離心制備了大量純化的HDAd／F載體，透射電鏡觀察顯示HDAd的直徑約為70 nm，具有典型的腺病毒形態(tài)，運用分光光度測定法分析表明純化后HDAd載體顆粒濃度為：7.4×10~(12)(vp／ml)，體外感染293細胞，RT-PCR檢測到F基因有轉(zhuǎn)錄，Western blot分析表明F蛋白有特異性表達。 結論成功構建HDAd／F載體并在真核細胞中實現(xiàn)表達，為體內(nèi)免疫學效力試驗奠定基礎，為研制RSV疫苗提供了一種新方法。
【圖文】：

圖3制備HDA出F載體的Cre幾oxP系統(tǒng)示意圖Fig3TheCre幾oxPsystemforgeneratingHDAd/Fveetors留約4ml，用吸管重懸沉淀，置于一80℃冰箱，30min，取出病毒置于室溫或37℃

在顯影液中顯影Zmin左右;定影10min至膠片透明;片10min，然后晾干保存。Cll鄺A3.1(+)/F重組質(zhì)粒本實驗室已法鑒定，在此基礎上使用限制性和pSCH，回收目的片段，將含連接，轉(zhuǎn)化、挑菌和搖菌，然后顯示，得到一條約2100bp的電
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R346

【參考文獻】

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本文編號：2567576