【摘要】： 第一部分HIV-Tat-CLIO標記對大鼠骨髓間充質干細胞生物學行為的影響 目的： 探討HIV-Tat蛋白轉導域交聯(lián)氧化鐵復合物(HIV transduction domaincross-linked iron oxide,HIV-Tat-CLIO)標記對體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質干細胞(rat marrow-derived mesenchymal stem cells,rMSCs)的可行性、劑量關系以及對細胞活力、增殖、分化和遷移能力等生物學行為的影響。 材料與方法： 原代培養(yǎng)rMSCs至第3代，檢測CD34，CD45和CD90的表達以鑒定之。不同濃度的HIV-Tat-CLIO標記rMSCs后利用普魯士鐵染色、體外MRI顯像及臺盼蘭細胞活性測定等方法確定最佳標記條件。用CLIO 25μg／ml和HIV-Tat-CLIO 25μg／ml分別標記rMSCs各24h，通過普魯士蘭鐵染色比較兩組納米鐵的細胞標記效率。運用普魯士蘭染色及掃描電鏡技術觀察鐵顆粒的細胞內存在部位。MTT實驗測定該標記方法對細胞增殖能力的影響；流式細胞儀測定標記前后細胞表面標記物的表達及細胞周期的變化；通過油紅0和堿性磷酸酶染色測定這種標記方法對rMSCs細胞分化能力的影響；Transwell實驗測定其對干細胞遷移能力的變化。 結果： 培養(yǎng)的第3代rMSCs CD34(-)，CD45(-)和CD90(+)。HIV-Tat-CLIO最佳標記濃度為25μg／ml。HIV-Tat-CLIO組較CLIO組在rMSCs的標記效率上獲得明顯改善。細胞標記后，A570波長的光吸收值無明顯變化；細胞表面CD34、CD45和CD90分子的表達無明顯差異；處于S期的MSCs數(shù)量(S％)、G_1％、增殖指數(shù)PrI值(S+G_2M)％以及細胞凋亡情況均無顯著改變；這種標記物對細胞分化和運動遷移能力均無顯著影響。 結論： HIV-Tat-CLIO標記大鼠MSCs后對其生物學行為無明顯影響，標記后的干細胞可以正常增殖、分化及運動遷移，為磁共振活體監(jiān)測干細胞移植后的動態(tài)變化提供有力的保證。 第二部分干細胞移植治療大鼠后肢缺血中HIV-Tat-CLIO標記磁共振體內示蹤的研究 目的： 探討磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)無創(chuàng)體內示蹤HIV-Tat-CLIO(HIV transduction domain cross-linked iron oxide)標記的移植大鼠骨髓間充質干細胞(rat Marrow-derived Mesenchymal Stem cells,rMSCs)的可行性和有效性，并且對該標記后的rMSCs移植治療大鼠后肢缺血的效果進行客觀評價。 材料和方法： 原代培養(yǎng)6周齡雄性SD大鼠的rMSCs至第3代，檢測CD34，CD45和CD90的表達以鑒定。用HIV-Tat-CLIO 25μg／ml標記rMSCs 24h。另有一組細胞繼續(xù)以5-溴脫氧尿苷(BrdU)3μg／ml復合標記rMSCs 24h。于大鼠右后肢缺血模型建立后的第7天進行rMSCs細胞移植。選用6周齡雄性SD大鼠28只，分為4組，，每組各7只。A組為移植HIV-Tat-CLIO標記的rMSCs；B組為移植HIV-Tat-CLIO及BrdU復合標記的rMSCs；C組為移植未標記的rMSCs；D組為注射同移植體積的無菌PBS液。分別在移植術后3d、1周、2周、4周進行MRI檢查示蹤HIV-Tat-CLIO標記的rMSCs分布情況(C組和D組僅于術后第3d進行MRI掃描1次)。在第4周各組均采用非致冷紅外熱成像儀檢測大鼠后肢皮膚溫度，進行缺血后肢的損傷評分，并進行DSA造影，之后處死所有大鼠進行組織學檢查。進行HE染色和普魯士蘭鐵染色，BrdU、Ⅷ因子免疫組化染色，并計算毛細血管密度。 結果 培養(yǎng)的第3代rMSCs CD34(-)，CD45(-)和CD90(+)。B組和C組各有1只實驗鼠因切口感染壞死，分別于術后第5天和第8天死亡，B組另有1只于移植術后第2周MRI檢查時麻醉意外死亡。其余25只均存活至術后第4周。MRI檢查：A組和B組在MRI上的顯示接近。C組和D組在MRI上無特殊信號變化。A組和B組在術后第3d，MRI顯示注射部位圓形低強度信號影；術后1周，MRI顯示原低信號灶呈中心向周圍擴散趨勢，信號呈顆粒狀，部位與隨后的組織學檢查結果一致；術后第2周見低密度影進一步擴散，信號強度有所弱化；術后第4周信號強度進一步弱化。低密度顆粒擴散范圍局限于原部位7mm處。非致冷紅外熱成像儀檢測大鼠后肢皮膚溫度發(fā)現(xiàn)：A、B、C和D組的右后肢平均皮膚溫度分別為32.12±0.51℃、32.39±0.61℃，31.97±0.56℃、31.16±0.67℃。A、B、C這3組間平均皮膚溫度無顯著性差異(P＞0.05)，A組與D組，B組與D組，C組與D組間均有顯著性差異(P＜0.05)。缺血后肢的損傷評分：A、B、C和D組的缺血后肢損傷評分分別為0.68±0.17、0.65±0.24、0.67±0.11、1.79±0.22。A、B、C這3組間缺血后肢損傷評分無顯著性差異(P＞0.05)，A組與D組，B組與D組，C組與D組間均有顯著性差異(P＜0.05)。DSA造影：A、B、C和D組的造影顯示大鼠缺血側后肢大腿部從股骨大轉子至股骨下段區(qū)域內的血管評分平均各為：2.56±0.37、2.51±0.29、2.58±0.26、1.33±0.41。A、B、C這3組間缺血后肢DSA造影血管評分無顯著性差異(P＞0.05)，A組與D組，B組與D組，C組與D組間均有顯著性差異(P＜0.05)。組織學檢查：A、B、C和D組的缺血后肢肌肉組織中毛細血管密度分別為570.35±68.17／mm~2、563.02±61.26／mm~2、576.97±77.87／mm~2、513.01±70.68／mm~2。A、B、C這3組間毛細血管密度無顯著性差異(P＞0.05)，A組與D組，B組與D組，C組與D組間均有顯著性差異(P＜0.05)。BrdU染色、普魯士鐵染色、Ⅷ因子免疫熒光及MRI的結果有良好的相關性。 結論 HIV-Tat-CLIO標記的rMSCs移植入大鼠后肢缺血模型后可以運用MRI進行動態(tài)監(jiān)測，根據(jù)低強度信號的范圍變化可以比較清晰的顯示移植后的rMSCs在宿主體內的遷移和分布。rMSCs移植能夠提高大鼠后肢缺血組織的血管再生能力，促進缺血肢體的血運重建和功能恢復，而HIV-Tat-CLIO標記并不影響rMSCs的治療作用。
【圖文】：

1.培養(yǎng)的rMsCS形態(tài)學觀察倒置顯微鏡下可見細胞呈現(xiàn)較強的貼壁生長特性，形態(tài)上呈紡錘形的成纖維細胞狀并呈有序的漩渦狀排列(圖2)。圖2:第3代rMscs為成纖維樣細胞形態(tài)呈有序的漩渦狀排列，倒置相差顯微鏡 (X100)。2.培養(yǎng)的rMSCS經(jīng)流式細胞儀鑒定第3代rMSCS的細胞表面CD34陰性表達，CD45I淚性表達，CDgO陽性表達。符合干細胞表面特異性標記物的表達(圖3)。一業(yè)些塑些匕一If\L止竺竺一」泛竺叢匕蘭竺些巴若甲義‘___一’田鉀0奪瑞r書護丁荒，p一4洲白曲1州日Zh.妒.心閱5伽貪飾篇概�！痮1“r‘一勸:.，.0.期呂，:，一;

2.培養(yǎng)的rMSCS經(jīng)流式細胞儀鑒定第3代rMSCS的細胞表面CD34陰性表達，CD45I淚性表達，CDgO陽性表達。符合干細胞表面特異性標記物的表達(圖3)。一業(yè)些塑些匕一If\L止竺竺一」泛竺叢匕蘭竺些巴若甲義‘___一’田鉀0奪瑞r書護丁荒，p一4洲白曲1州日Zh.妒.心閱5伽貪飾篇概�！痮1“r‘一勸:.，.0.期呂，:，一;，。一，一。論月11閃刀O口p.目h一It力00 !!!:::lll尸尸火、 、r毛毛一:公二y一卜0眾拍M日幽.1%心Jted，一一峋-一一月任Ico刀幻po以枷一腸刀叼呂N容月呂一0O一呂CD洲卜l代B功幼節(jié)目U.的7C卜心F欣8日奈Z卜的，自岡以)5毓目公 IOD1502閱Z乏D向陽臼d枷目田圖3:第3代rMSCs經(jīng)流式細胞儀鑒定CD34卜)
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R329

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本文編號：2561694