【摘要】： 第一部分HIV-Tat-CLIO標(biāo)記對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 目的： 探討HIV-Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域交聯(lián)氧化鐵復(fù)合物(HIV transduction domaincross-linked iron oxide,HIV-Tat-CLIO)標(biāo)記對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat marrow-derived mesenchymal stem cells,rMSCs)的可行性、劑量關(guān)系以及對(duì)細(xì)胞活力、增殖、分化和遷移能力等生物學(xué)行為的影響。 材料與方法： 原代培養(yǎng)rMSCs至第3代，檢測(cè)CD34，CD45和CD90的表達(dá)以鑒定之。不同濃度的HIV-Tat-CLIO標(biāo)記rMSCs后利用普魯士鐵染色、體外MRI顯像及臺(tái)盼蘭細(xì)胞活性測(cè)定等方法確定最佳標(biāo)記條件。用CLIO 25μg／ml和HIV-Tat-CLIO 25μg／ml分別標(biāo)記rMSCs各24h，通過(guò)普魯士蘭鐵染色比較兩組納米鐵的細(xì)胞標(biāo)記效率。運(yùn)用普魯士蘭染色及掃描電鏡技術(shù)觀察鐵顆粒的細(xì)胞內(nèi)存在部位。MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定該標(biāo)記方法對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響；流式細(xì)胞儀測(cè)定標(biāo)記前后細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)及細(xì)胞周期的變化；通過(guò)油紅0和堿性磷酸酶染色測(cè)定這種標(biāo)記方法對(duì)rMSCs細(xì)胞分化能力的影響；Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定其對(duì)干細(xì)胞遷移能力的變化。 結(jié)果： 培養(yǎng)的第3代rMSCs CD34(-)，CD45(-)和CD90(+)。HIV-Tat-CLIO最佳標(biāo)記濃度為25μg／ml。HIV-Tat-CLIO組較CLIO組在rMSCs的標(biāo)記效率上獲得明顯改善。細(xì)胞標(biāo)記后，A570波長(zhǎng)的光吸收值無(wú)明顯變化；細(xì)胞表面CD34、CD45和CD90分子的表達(dá)無(wú)明顯差異；處于S期的MSCs數(shù)量(S％)、G_1％、增殖指數(shù)PrI值(S+G_2M)％以及細(xì)胞凋亡情況均無(wú)顯著改變；這種標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞分化和運(yùn)動(dòng)遷移能力均無(wú)顯著影響。 結(jié)論： HIV-Tat-CLIO標(biāo)記大鼠MSCs后對(duì)其生物學(xué)行為無(wú)明顯影響，標(biāo)記后的干細(xì)胞可以正常增殖、分化及運(yùn)動(dòng)遷移，為磁共振活體監(jiān)測(cè)干細(xì)胞移植后的動(dòng)態(tài)變化提供有力的保證。 第二部分干細(xì)胞移植治療大鼠后肢缺血中HIV-Tat-CLIO標(biāo)記磁共振體內(nèi)示蹤的研究 目的： 探討磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)無(wú)創(chuàng)體內(nèi)示蹤HIV-Tat-CLIO(HIV transduction domain cross-linked iron oxide)標(biāo)記的移植大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat Marrow-derived Mesenchymal Stem cells,rMSCs)的可行性和有效性，并且對(duì)該標(biāo)記后的rMSCs移植治療大鼠后肢缺血的效果進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)。 材料和方法： 原代培養(yǎng)6周齡雄性SD大鼠的rMSCs至第3代，檢測(cè)CD34，CD45和CD90的表達(dá)以鑒定。用HIV-Tat-CLIO 25μg／ml標(biāo)記rMSCs 24h。另有一組細(xì)胞繼續(xù)以5-溴脫氧尿苷(BrdU)3μg／ml復(fù)合標(biāo)記rMSCs 24h。于大鼠右后肢缺血模型建立后的第7天進(jìn)行rMSCs細(xì)胞移植。選用6周齡雄性SD大鼠28只，分為4組，，每組各7只。A組為移植HIV-Tat-CLIO標(biāo)記的rMSCs；B組為移植HIV-Tat-CLIO及BrdU復(fù)合標(biāo)記的rMSCs；C組為移植未標(biāo)記的rMSCs；D組為注射同移植體積的無(wú)菌PBS液。分別在移植術(shù)后3d、1周、2周、4周進(jìn)行MRI檢查示蹤HIV-Tat-CLIO標(biāo)記的rMSCs分布情況(C組和D組僅于術(shù)后第3d進(jìn)行MRI掃描1次)。在第4周各組均采用非致冷紅外熱成像儀檢測(cè)大鼠后肢皮膚溫度，進(jìn)行缺血后肢的損傷評(píng)分，并進(jìn)行DSA造影，之后處死所有大鼠進(jìn)行組織學(xué)檢查。進(jìn)行HE染色和普魯士蘭鐵染色，BrdU、Ⅷ因子免疫組化染色，并計(jì)算毛細(xì)血管密度。 結(jié)果 培養(yǎng)的第3代rMSCs CD34(-)，CD45(-)和CD90(+)。B組和C組各有1只實(shí)驗(yàn)鼠因切口感染壞死，分別于術(shù)后第5天和第8天死亡，B組另有1只于移植術(shù)后第2周MRI檢查時(shí)麻醉意外死亡。其余25只均存活至術(shù)后第4周。MRI檢查：A組和B組在MRI上的顯示接近。C組和D組在MRI上無(wú)特殊信號(hào)變化。A組和B組在術(shù)后第3d，MRI顯示注射部位圓形低強(qiáng)度信號(hào)影；術(shù)后1周，MRI顯示原低信號(hào)灶呈中心向周圍擴(kuò)散趨勢(shì)，信號(hào)呈顆粒狀，部位與隨后的組織學(xué)檢查結(jié)果一致；術(shù)后第2周見(jiàn)低密度影進(jìn)一步擴(kuò)散，信號(hào)強(qiáng)度有所弱化；術(shù)后第4周信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)一步弱化。低密度顆粒擴(kuò)散范圍局限于原部位7mm處。非致冷紅外熱成像儀檢測(cè)大鼠后肢皮膚溫度發(fā)現(xiàn)：A、B、C和D組的右后肢平均皮膚溫度分別為32.12±0.51℃、32.39±0.61℃，31.97±0.56℃、31.16±0.67℃。A、B、C這3組間平均皮膚溫度無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，A組與D組，B組與D組，C組與D組間均有顯著性差異(P＜0.05)。缺血后肢的損傷評(píng)分：A、B、C和D組的缺血后肢損傷評(píng)分分別為0.68±0.17、0.65±0.24、0.67±0.11、1.79±0.22。A、B、C這3組間缺血后肢損傷評(píng)分無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，A組與D組，B組與D組，C組與D組間均有顯著性差異(P＜0.05)。DSA造影：A、B、C和D組的造影顯示大鼠缺血側(cè)后肢大腿部從股骨大轉(zhuǎn)子至股骨下段區(qū)域內(nèi)的血管評(píng)分平均各為：2.56±0.37、2.51±0.29、2.58±0.26、1.33±0.41。A、B、C這3組間缺血后肢DSA造影血管評(píng)分無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，A組與D組，B組與D組，C組與D組間均有顯著性差異(P＜0.05)。組織學(xué)檢查：A、B、C和D組的缺血后肢肌肉組織中毛細(xì)血管密度分別為570.35±68.17／mm~2、563.02±61.26／mm~2、576.97±77.87／mm~2、513.01±70.68／mm~2。A、B、C這3組間毛細(xì)血管密度無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，A組與D組，B組與D組，C組與D組間均有顯著性差異(P＜0.05)。BrdU染色、普魯士鐵染色、Ⅷ因子免疫熒光及MRI的結(jié)果有良好的相關(guān)性。 結(jié)論 HIV-Tat-CLIO標(biāo)記的rMSCs移植入大鼠后肢缺血模型后可以運(yùn)用MRI進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，根據(jù)低強(qiáng)度信號(hào)的范圍變化可以比較清晰的顯示移植后的rMSCs在宿主體內(nèi)的遷移和分布。rMSCs移植能夠提高大鼠后肢缺血組織的血管再生能力，促進(jìn)缺血肢體的血運(yùn)重建和功能恢復(fù)，而HIV-Tat-CLIO標(biāo)記并不影響rMSCs的治療作用。
【圖文】：

1.培養(yǎng)的rMsCS形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的貼壁生長(zhǎng)特性，形態(tài)上呈紡錘形的成纖維細(xì)胞狀并呈有序的漩渦狀排列(圖2)。圖2:第3代rMscs為成纖維樣細(xì)胞形態(tài)呈有序的漩渦狀排列，倒置相差顯微鏡 (X100)。2.培養(yǎng)的rMSCS經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定第3代rMSCS的細(xì)胞表面CD34陰性表達(dá)，CD45I淚性表達(dá)，CDgO陽(yáng)性表達(dá)。符合干細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物的表達(dá)(圖3)。一業(yè)些塑些匕一If\L止竺竺一」泛竺叢匕蘭竺些巴若甲義‘___一’田鉀0奪瑞r書(shū)護(hù)丁荒，p一4洲白曲1州日Z(yǔ)h.妒.心閱5伽貪飾篇概�！痮1“r‘一勸:.，.0.期呂，:，一;

2.培養(yǎng)的rMSCS經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定第3代rMSCS的細(xì)胞表面CD34陰性表達(dá)，CD45I淚性表達(dá)，CDgO陽(yáng)性表達(dá)。符合干細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物的表達(dá)(圖3)。一業(yè)些塑些匕一If\L止竺竺一」泛竺叢匕蘭竺些巴若甲義‘___一’田鉀0奪瑞r書(shū)護(hù)丁荒，p一4洲白曲1州日Z(yǔ)h.妒.心閱5伽貪飾篇概�！痮1“r‘一勸:.，.0.期呂，:，一;，。一，一。論月11閃刀O口p.目h一It力00 !!!:::lll尸尸火、 、r毛毛一:公二y一卜0眾拍M日幽.1%心Jted，一一峋-一一月任Ico刀幻po以枷一腸刀叼呂N容月呂一0O一呂CD洲卜l代B功幼節(jié)目U.的7C卜心F欣8日奈Z卜的，自岡以)5毓目公 IOD1502閱Z乏D向陽(yáng)臼d枷目田圖3:第3代rMSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定CD34卜)
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2561694