【摘要】： 人偏肺病毒human metapneumovirus,簡稱hMPV,是荷蘭學(xué)者Van den Hoogen等于2001年從患急性呼吸道感染的嬰幼兒臨床標(biāo)本中首次分離鑒定出的一種新病毒,它與禽類肺病毒(APV)的C型有較高的同源性,已歸屬于副粘病毒科肺病毒亞科。其全基因組除了一部分終止序列未明外已克隆成功。hMPV基因組為負(fù)鏈RNA病毒,包括8個基因和9個開放閱讀框架�；蚪M編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白有核蛋白(nucleoprotein,N)、基質(zhì)蛋白(matrix protein,M)、融合蛋白(fusionprotein,F)、附著蛋白(attachment glycoprotein,G),其中F和G蛋白均為糖蛋白。另外還有磷蛋白P、22K蛋白M2和M2.2、小疏水蛋白SH、大多聚酶蛋白L。各蛋白基因組排列模式為3'-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5'。目前的研究認(rèn)為hMPV可能是一種常見的呼吸道感染病毒,在呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒陰性的呼吸道感染標(biāo)本中其檢出率可達(dá)10%,在上或下呼吸道甚至上下呼吸道中均有檢出,兒童和成人均有感染,尤其是早產(chǎn)兒、老人及有免疫缺陷的患者更易患hMPV感染。hMPV作為新發(fā)現(xiàn)的人類急性呼吸道感染的病毒已越來越受到人們的重視。 當(dāng)前hMPV的診斷只限于實(shí)驗(yàn)研究,由于用作病毒培養(yǎng)的常用細(xì)胞系不支持hMPV的復(fù)制,hMPV生長緩慢、病變不典型且其在體外復(fù)制需要依賴胰酶,故采用通常的臨床病毒學(xué)方法很難鑒定hMPV�，F(xiàn)在主要依賴于RT-PCR檢測病毒的RNA對它進(jìn)行研究。要對hMPV進(jìn)行深入研究并弄清它在我國各年齡組人群中的感染狀況急需病毒分離株或特異性抗原,但由于人類偏肺病毒不出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變,在組織培養(yǎng)中分離十分困難,通過分子生物學(xué)手段獲得特異性抗原用于研究就成為可行之路。 本研究組已經(jīng)獲得了北京地區(qū)hMPV基因序列,在試圖分離病毒株的同時,嘗試運(yùn)用不同的表達(dá)系統(tǒng)(細(xì)菌,酵母,昆蟲)對人偏肺病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白(N,F)進(jìn)行了表達(dá)。之所以選擇N和F蛋白,是因?yàn)镹蛋白(nucleoprotein 1182bp,394aa)是核蛋白,氨基酸序列最保守,在不同的基因型別的病毒間差異最小。而F蛋白(fusion protein,1620bp,539aa)是一個糖蛋白,文獻(xiàn)報(bào)道它是hMPV最主要的能引起中和保護(hù)性抗體的抗原。 實(shí)施課題的第一階段:為了便于蛋白純化,在蛋白的N端加入了一個6His標(biāo)簽和相應(yīng)的酶切位點(diǎn),構(gòu)建了重組pBh1887N(K)質(zhì)粒(用于Bac-N-blu體系)和重組pFh1887N質(zhì)粒(用于Bac-to-Bac體系),測序均正確。雖然昆蟲Bac-N-blu體系中感染昆蟲細(xì)胞所收獲的上清進(jìn)行藍(lán)蝕班篩選,出現(xiàn)了藍(lán)斑;昆蟲Bac-to-Bac體系中感染昆蟲細(xì)胞所收獲的上清進(jìn)行PCR鑒定有目的基因的插入都說明桿狀病毒中有目的基因的插入,但是對感染72小時收獲的昆蟲細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot(分別用His抗體和hMPV N蛋白特異性抗體檢測),在SDS-PAGE上未觀察到目的蛋白大小處有明顯的大量蛋白表達(dá),Western blot也沒有檢測到目的蛋白。 實(shí)施課題的第二階段:考慮是否該N端his標(biāo)簽阻礙了蛋白的表達(dá)。嘗試變換標(biāo)簽的位置到蛋白的C端,并嘗試在多體系中表達(dá)。構(gòu)建了重組pB1887N質(zhì)粒(用于Bac-N-blu體系),重組pF1887Nh質(zhì)粒(用于Bac-to-Bac體系),單拷貝/雙拷貝的pAOα1887Nh重組質(zhì)粒(用于酵母表達(dá)系統(tǒng)),pET1887Nh重組質(zhì)粒(用于細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)),測序均正確。前兩個昆蟲表達(dá)體系在收獲了感染72小時后的昆蟲細(xì)胞后,進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot(分別用His抗體和hMPV N蛋白特異性抗體檢測)。在SDS-PAGE上未觀察到目的蛋白大小處有明顯的大量蛋白表達(dá),Western blot可以檢測到目的蛋白的表達(dá)。酵母表達(dá)系統(tǒng)無論單雙拷貝,培養(yǎng)基上清雖然在SDS-PAGE上可見到43Kd處有蛋白出現(xiàn),且不同克窿、菌株相對于對照載體菌表達(dá)的量不一樣,但是進(jìn)行Western blot使用his抗體和特異性抗體卻沒有檢測出目的蛋白。通過PCR可以鑒定到酵母基因組中已同源重組入目的基因。細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)有較好的表達(dá)并能通過Western blot(分別用His抗體和hMPV N蛋白特異性抗體檢測)鑒定目的蛋白表達(dá)。 實(shí)施課題的第三階段:在N蛋白嘗試表達(dá)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了重組pB1816F質(zhì)粒(用于Bac-N-blu體),重組pF1816Nh質(zhì)粒(用于Bac-to-Bac體系),測序均正確。Bac-to-Bac體系所收獲的感染72小時后的昆蟲細(xì)胞裂解液,進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot(分別用His抗體和hMPV F蛋白特異性抗體檢測)。在SDS-PAGE上未觀察到目的蛋白大小處有明顯的大量蛋白表達(dá),Western blotHis抗體未檢測到目的蛋白,而F蛋白特異性抗體檢測在60kD可看到條帶出現(xiàn)。Bac-N-blu體系所收獲的感染72小時后的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液得到藍(lán)蝕斑。 實(shí)施課題的第四階段:選擇昆蟲體系陽性重組病毒(N蛋白),擴(kuò)大感染規(guī)模,his標(biāo)簽純化N蛋白,進(jìn)行臨床血清學(xué)的調(diào)查鑒定,并同細(xì)菌表達(dá)的N蛋白測定結(jié)果進(jìn)行比較,正在進(jìn)行中。 綜合以上結(jié)果說明:偏肺病毒蛋白在不同的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)難易不同,N蛋白在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中最易表達(dá),但F蛋白表達(dá)受阻,可能跟其具有一定毒性,結(jié)構(gòu)復(fù)雜有關(guān);酵母體系有可能對N蛋白有修飾作用,使其無法被特異的短肽抗體所識別,F蛋白在構(gòu)建表達(dá)載體時即受阻,無法同前導(dǎo)肽相連;昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)對N,F蛋白均可以表達(dá),但表達(dá)的量較低,有可能同初期重組病毒滴度低有關(guān),而且昆蟲細(xì)胞的狀態(tài)好壞對蛋白表達(dá)影響較大,優(yōu)化不易。在表達(dá)N蛋白時,構(gòu)建了N端his標(biāo)簽和C端his標(biāo)簽的兩種重組質(zhì)粒,前者沒有表達(dá)而后者順利表達(dá),測序結(jié)果均正確,無讀碼框的移位,提示his標(biāo)簽對N蛋白表達(dá)產(chǎn)生了阻扼作用,通過結(jié)構(gòu)分析考慮應(yīng)是在轉(zhuǎn)錄的mRNA起始處產(chǎn)生復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu),影響了翻譯的進(jìn)行,需要在以后蛋白的表達(dá)中注意。 通過研究各表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)hMPV病毒蛋白,以期能夠找到一種理想的表達(dá)體系,所表達(dá)的病毒蛋白可以用于接下來的血清學(xué)應(yīng)用和病毒顆粒組裝的研究。從而能夠?qū)MPV本身,感染的臨床癥狀和流行病學(xué)方面進(jìn)行全面的研究,更好地認(rèn)識hMPV感染與其所引發(fā)的疾病,找到有效的治療措施。
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R373

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10 魏n，

本文編號：2561432