【摘要】： 背景: 嗜酸粒細(xì)胞在變應(yīng)性炎癥局部募集和活化、以及嗜酸粒細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)的作用導(dǎo)致了變應(yīng)性鼻炎發(fā)生。嗜酸粒細(xì)胞在炎癥局部的募集是由趨化因子介導(dǎo)。Eotaxin是作用最強(qiáng)的嗜酸粒細(xì)胞趨化因子,其通過(guò)與表達(dá)于嗜酸粒細(xì)胞表面的惟一受體CCR3結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。研究已表明采用抗CCR3抗體等阻斷CCR3-Eotaxin軸的作用可緩解變應(yīng)性疾病。對(duì)野生型Eotaxin結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)性的研究顯示Eotaxin N氨基末端在其與受體結(jié)合后的信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。突變其N氨基末端將極大地改變Eotaxin的生物學(xué)活性,并可望獲得具有與CCR3結(jié)合能力而不能引起相應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)的CCR3拮抗劑。理論上,由于CCR3是Eotaxin的惟一受體,Eotaxin突變體拮抗CCR3的作用強(qiáng)、特異性高。 目的: 本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)基因操作技術(shù),獲得人嗜酸粒細(xì)胞親合素Eotaxin基因,構(gòu)建系列的Eotaxin N端突變體及其原核表達(dá)載體,為進(jìn)一步純化和檢測(cè)其生物學(xué)活性,篩選CCR3拮抗劑做準(zhǔn)備。 方法: 1、從脾臟提取總RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增編碼人Eotaxin全長(zhǎng)cDNA序列,然后將目的片段克隆至T載體(pTZ57R),得到重組質(zhì)粒PT-Eotaxin,重組質(zhì)粒用Eotaxin特異性引物進(jìn)行PCR鑒定,并用內(nèi)切酶KpnⅠ,XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定,最后送上海博亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列分析。 2、根據(jù)PT-Eotaxin的序列,使用突變引物設(shè)計(jì)軟件,針對(duì)Eotaxin成熟鏈N末端設(shè)計(jì)8對(duì)特異性點(diǎn)突變引物,用點(diǎn)突變的方法,在PT-Eotaxin的基礎(chǔ)上用Met替代(單個(gè))Eotaxin N-端肽氨基酸殘基,突變PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌XLl-Blue后用氨芐青霉素篩選,獲得突變體重組子(Met-Eotaxins),選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列分析。 3、根據(jù)突變體重組子-Met-Eotaxins成熟鏈部分序列,自行設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物,擴(kuò)增野生型及各突變體的成熟鏈片段,使用定向克隆技術(shù)將目的片段克隆到原核表達(dá)載體pET30a(+)上,重組子用卡那霉素進(jìn)行篩選,陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后用T7引物做PCR鑒定,內(nèi)切酶KpnⅠ,XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定,最后進(jìn)行序列測(cè)定,獲得重組表達(dá)質(zhì)粒(pET30a(+)-Eotaxin,pET30a(+)-Met-Eotaxins)。 4、將鑒定正確的9個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化表達(dá)型宿主菌Ecoli BL21(DE3),經(jīng)篩選后即得特異性表達(dá)Eotaxin和Met-Eotaxins成熟鏈融合蛋白的工程菌。將單克隆工程菌接種到50ml含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃搖菌培養(yǎng)到對(duì)數(shù)中期(OD600=0.5～1.0),加入IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)1～6h,收集菌體。對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)物分別進(jìn)行SDS-PAGE和Western-Blot分析。 結(jié)果: 1.重組質(zhì)粒PT-Eotaxin,用Eotaxin特異性引物進(jìn)行PCR鑒定,以及用內(nèi)切酶KpnⅠ,XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定,PCR擴(kuò)增片段與酶切片段實(shí)際大小均與理論大小一致;序列分析結(jié)果與genbank對(duì)照,完全符合。 2.突變體重組子(Met-Eotaxins)序列分析結(jié)果經(jīng)對(duì)照發(fā)現(xiàn),我們得到的突變體與設(shè)計(jì)完全一致。 3.重組表達(dá)質(zhì)粒(pET30a(+)-Eotaxin,pET30a(+)-Met-Eotaxins)用特異性引物(T7)進(jìn)行PCR鑒定,以及用內(nèi)切酶KpnⅠ,XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定,PCR擴(kuò)增片段與酶切片段實(shí)際大小均與理論大小一致,序列分析結(jié)果表明,各重組表達(dá)質(zhì)粒中,Eotaxin與Met-Eotaxins的核苷酸序列完全正確,讀碼框無(wú)移位。 4.重組表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)產(chǎn)物SDS-PAGE分析結(jié)果表明,各重組表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物中均有相應(yīng)的融合蛋白表達(dá),而且各重組融合蛋白表達(dá)水平較高,表達(dá)量可達(dá)總蛋白量的32～35.5%。進(jìn)一步Western-Blot分析表明,各融合蛋白均能和特異性Eotaxin一抗結(jié)合,證實(shí)所表達(dá)的確系目的蛋白。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)成功克隆了Eotaxin基因,成功的構(gòu)建了一系列EotaxinN末端的突變體重組子(Met-Eotaxins),并成功的構(gòu)建了Eotaxin及其一系列N末端的突變體成熟鏈的重組原核表達(dá)質(zhì)粒(pET30a(+)-Eotaxin,pET30a(+)-Met-Eotaxins),各重組融合蛋白獲得了正確的表達(dá)。系列Eotaxin N端突變體和其原核表達(dá)載體的成功構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá),為進(jìn)一步純化出相應(yīng)蛋白,并篩選出CCR3拮抗劑奠定了良好的基礎(chǔ)。
【圖文】：

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，M為marker(DL2O00)，l、2、3泳道為選取的3個(gè)陽(yáng)性重組子的PCR產(chǎn)物

3.重組表達(dá)質(zhì)粒(pET3Oa(+)一Eotaxin，，pE丁3oa(+)一Mer一Eotaxins)的鑒定3.1用特異性引物(T7)進(jìn)行PCR鑒定，以及用內(nèi)切酶Kpnl，xhol進(jìn)行雙酶切鑒定，PCR擴(kuò)增片段與酶切片段實(shí)際大小均與理論大小一致。(圖4一6)圖4重組表達(dá)質(zhì)粒pET3oa(+)一Eotaxin的peR及酶切產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，MI為Marke:I，MZ為Marker八，l、3、5、7泳道為選取的4個(gè)陽(yáng)性重組子的PCR產(chǎn)物，2、4、6、8泳道為選取的4個(gè)陽(yáng)性重組子的酶切產(chǎn)物。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R765.21;R346

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本文編號(hào)：2558466