發(fā)布時(shí)間：2019-11-06 23:26

【摘要】： 將本室構(gòu)建保存的含肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae,Cpn)主要外膜蛋白(Maior Outer Membrane Protein,MOMP)優(yōu)勢(shì)表位(147～297aa)基因的重組表達(dá)體在大腸桿菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行抗原性分析。應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，將SP2/0細(xì)胞與經(jīng)重組Cpn MOMP_(VD2-VD3)免疫的雌性BALB/c小鼠脾細(xì)胞融合，篩選抗重組MOMP_(VD2-VD3)的單克隆抗體(Monoclonal Antibody,MAb)，并進(jìn)行純化和鑒定。用此MAb檢測(cè)Cpn感染病人的標(biāo)本，由此確定該MAb的應(yīng)用價(jià)值，并為衣原體感染診斷的研究奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)使用鎳親和層析方法純化重組MOMP_(VD2-VD3)。利用SDS-PAGE和Western-Blot分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物。(2)以純化的重組MOMP_(VD2-VD3)免疫雌性BALB/c小鼠，將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)篩選抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。(3)收集接種過雜交瘤細(xì)胞的小鼠腹水，分別用間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)、用MAb分型試劑盒鑒定MAb的類別、用微量熒光免疫試驗(yàn)(Microimmunofluorescence assay，MIF)檢測(cè)MAb的特異性。(4)通過建立MIF檢測(cè)Cpn感染病人和正常人外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：重組目的基因表達(dá)菌在IPTG的誘導(dǎo)下，表達(dá)了相對(duì)分子量(Molecular weight,Mw)約為24KDa的目的蛋白，主要以包涵體形式存在；經(jīng)Ni-NTA親和層析純化獲得了純度在95％以上的重組蛋白；Western-Blot檢測(cè)其能與Anti-HisMAb發(fā)生特異性反應(yīng)；應(yīng)用純化復(fù)性后的重組MOMP_(VD2-VD3)免疫雌性BALB/c小鼠，經(jīng)過雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合；應(yīng)用ELISA方法篩選了3株針對(duì)重組MOMP_(VD2-VD3)的MAb，分別命名為5D6、7G3、8C9；Western-Blot結(jié)果顯示3株MAb與重組MOMP_(VD2-VD3)具有良好的免疫反應(yīng)性；腹水誘生法大量制各MAb；間接ELISA檢測(cè)3株雜交瘤誘生的腹水中MAb效價(jià)分別為1:51200、1:25600、1:25600；使用硫酸銨沉淀法對(duì)腹水中的MAb進(jìn)行純化；根據(jù)MAb親和常數(shù)公式計(jì)算3株MAb親和常數(shù)分別為52μg/mL、48μg/mL、47μg/mL；經(jīng)Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit測(cè)定，3株MAb重鏈均為IgGl，輕鏈均為κ；對(duì)96例Cpn感染病人的PBMC進(jìn)行MIF檢測(cè)，自制MAb的Cpn感染檢出率與臨床Cpn IgG診斷試劑盒的檢出率的復(fù)合率為96.9％。 結(jié)論： (1)制備了3株穩(wěn)定分泌Cpn MAb的細(xì)胞株，經(jīng)鑒定3種MAb均能識(shí)別重組MOMP_(VD2-VD3)，具有較好的特異性。 (2)獲得Cpn MOMP_(VD2-VD3)MAb為IgG類。 (3)自制MAb的特異性和敏感性與商品化的Cpn IgG診斷試劑盒比較具有較好的一致性。
【圖文】：

MOMPvoZ一vD3重組蛋白純化的sDs~PAGE結(jié)果aoa行515ofpurioedMoMp粗z一卿~，bi.a，tp，CedPET3O，MOMPvDZ一vD3;2.Celllysate;3.FIOwthr200mM);5.Eluates(咪哇濃度:250血M);6.Pr性分析為一抗，，研陌stem一Blot分析MOMPvDZ一vD3重和純化蛋白在同一位置出現(xiàn)了單一特異性條帶，見圖2o123…爭(zhēng)_氣一侍氣{一J一J_砂獷飛‘一誘內(nèi)硯泌重組蛋白MOMP切z~的M觸，ternblot分析
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R374

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 周林福,朱海紅,陳離偉,周云連;肺炎衣原體膜表面蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建[J];科技通報(bào);2004年02期

2 劉廣超;吳移謀;;肺炎嗜衣原體診斷方法的研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2006年04期

3 劉鋼,胡翼云,趙德環(huán),李紅莉,王樹欣,江載芳,楊永弘;巢式聚合酶鏈反應(yīng)診斷肺炎衣原體感染的臨床應(yīng)用探討[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2001年04期

本文編號(hào)：2556976