【摘要】：目的 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建表達(dá)人突變CD59蛋白的重組真核表達(dá)載體,建立突變?nèi)薈D59真核表達(dá)系統(tǒng),獲得高效表達(dá)突變?nèi)薈D59蛋白的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞株。經(jīng)凋亡相關(guān)基因--Fas、Bcl-2、NF-кB的表達(dá)情況,證實突變?nèi)薈D59在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用,為腫瘤免疫逃逸機(jī)理的研究提供依據(jù)。 方法采用基因定點突變技術(shù)構(gòu)建CD59突變基因,設(shè)計互補突變引物和常規(guī)引物,以已構(gòu)建CD59cDNA重組質(zhì)粒為模板,重組PCR定點誘變擴(kuò)增突變基因,EcoRI酶切重組入真核表達(dá)質(zhì)粒pALTER-MAX。利用陽離子脂質(zhì)體(Lipofectamine-2000)導(dǎo)入法將含有突變?nèi)薈D59的重組pALTER-MAX質(zhì)粒與PcDNA3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),用新霉素類似物G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆。通過熒光免疫組化(FIH)、酶免疫組化(EIH)、流式細(xì)胞儀法(FACS)和免疫印跡技術(shù)(Western blot)檢測篩選CD59突變基因高表達(dá)株。經(jīng)免疫組織化學(xué)染色試驗檢測轉(zhuǎn)染前后CHO細(xì)胞凋亡相關(guān)基因--Fas、Bcl-2、NF-кB的表達(dá)情況。 結(jié)果 PCR定點誘變成功獲得目的CD59突變基因,序列測定及酶切鑒定均證實成功構(gòu)建了pALTER-MAX-突變CD59重組真核表達(dá)載體系統(tǒng)。運用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法將含有突變?nèi)薈D59的pALTER-MAX重組質(zhì)粒與PcDNA3共轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞,用含有400ug/mlG418的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)兩周,篩選出穩(wěn)定陽性表達(dá)克隆,繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。篩選出的陽性克隆細(xì)胞以熒光抗體技術(shù)、免疫酶標(biāo)技術(shù)檢測,表明在細(xì)胞膜表面有突變?nèi)薈D59分子的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測并
【圖文】：

插入的基因片段為49b5p，故重組pALI王R一MAX一突變CD59長約6kb。EocRlI酶切重組質(zhì)粒后于sooPb處見一條帶(圖1)，，從而確定所構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擴(kuò)增成功。1234520X()PbInnn卜”75b0P500bP25b0P10b0P_495bP圖1重組質(zhì)粒pATLEReeMAX一突變CD59的酶切鑒定:DNADI田火er2:pATLE-RMAX一突變CD59重組質(zhì)粒3:EcofRI酶切pALTE-RMAx一突變CD59重組質(zhì)粒:4pALTE-RMAx一突變CD59重組質(zhì)粒:5Ec。很I酶切pALTER.MAx一突變CD59重組質(zhì)粒二、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后經(jīng)以18篩選的陽性克隆

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCO細(xì)胞經(jīng)G418篩選兩周后形成的陽性克隆(lX)
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R392

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本文編號：2556593