【摘要】：目的篩選噬菌體展示隨機(jī)12 肽庫中可以與HCV 抗體陽性的血清特異性結(jié)合的序列,在HCV 表達(dá)的蛋白分子上找到這個抗原表位, 分析其序列、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與功能的關(guān)系。同時檢驗(yàn)用陰性血清逆向篩選是否能提高篩選效率。從而探討用噬菌體展示技術(shù)模擬HCV 抗原表位短肽,并用于對HCV 抗體檢測的應(yīng)用前景。 方法1. 用飽和硫酸銨鹽析法初提HCV 血清免疫球蛋白,再用DEAESehpadex A-50 進(jìn)一步純化。SDS-PAGE 鑒定純化蛋白的純度,ELISA 檢測純化蛋白的活性。2. 用純化免疫球蛋白對噬菌體展示隨機(jī)12 肽庫進(jìn)行3 輪親和篩選并同時進(jìn)行HCV 陰性血清逆向篩選。3. ELISA 方法檢測各輪篩選的富集效果以及第三輪篩選后隨機(jī)挑選的26 個噬菌體單克隆和HCV 陰性和陽性血清反應(yīng)的特異性。4. Western blot 檢測各陽性噬菌體單克隆展示多肽表位的類型以及篩選后所得噬菌體多克隆所展示多肽的抗原類型。5. 提取特異性噬菌體克隆單鏈DNA 并測定插入的外源序列。6. 利用生物信息學(xué)軟件呈現(xiàn)噬菌體展示多肽的三維結(jié)構(gòu);分析表位多肽的抗原相關(guān)性質(zhì)。 結(jié)果1) 經(jīng)過兩步純化后收集到免疫球蛋白的洗脫混合液,經(jīng)SDS-PAGE電泳后未見雜帶,達(dá)到電泳純。純化免疫球蛋白與HCV抗原ELISA反應(yīng)結(jié)果為強(qiáng)陽性。2) 在第二輪篩選中經(jīng)HCV陰性血清逆向篩選后的產(chǎn)出較對照明顯偏低。對照孔產(chǎn)出/投入為5.0×10-5,經(jīng)逆向吸收的篩選孔產(chǎn)出/投入為4.4×10-8。第三輪的產(chǎn)出/投入值較第二輪提高30多倍。3) ELISA檢測發(fā)現(xiàn)在26個噬菌體單克隆中有5個克隆能與多份HCV陽性血清結(jié)合而不與陰性血清反應(yīng),顯示較好的特異性(P0.05)。Western blot顯示第三輪篩選收集的多克隆噬菌體中存在HCV線性表位。4) 經(jīng)DNA測序發(fā)現(xiàn)5個克隆有2個克隆的DNA序列是完全相同的,即5個克隆包含了4種不同的抗原表位;同源性分析顯示YFQVGLESIPRP 與HCV蛋白分子1082～1093位的氨基酸同源性較高,而MNALRPLSPWPT與1954～1965位氨基酸同源性較高。5)與篩選表位序列YFQVGLESIPRP相同或相似的氨基酸在蛋白三維結(jié)構(gòu)上緊密相連,形成抗原應(yīng)有的構(gòu)象。兩個表位在HCV蛋白上的同源區(qū)表現(xiàn)出較好的抗原性質(zhì)。
【圖文】：

結(jié)果純化及鑒定后的免疫球蛋白經(jīng)過 DEAE Sephadex A50 層析看到一個明顯的免疫球蛋白吸收峰（圖 1），收混合作為備用靶分子。分光光度計(jì)檢測濃度為 A-50 純化的 HCV 陽性血清 IgG 達(dá)到電泳純(圖化的抗體為強(qiáng)陽性。

LISA 結(jié)果輪篩選的產(chǎn)出物滴度測定平板（圖 4）上隨機(jī)挑取 26 個菌落分別 陽性血清和 20 份陰性血清進(jìn)行 ELISA 實(shí)驗(yàn)鑒定各克隆的特異性。表示如下(圖 5、6、7、8，具體數(shù)據(jù)見表 2、3)�？寺� P2、P5、P6陽性血清反應(yīng)的陽性率依次為 6/8、6/8、4/8、5/8、3/8，且均不與反應(yīng)。用 SAS 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析各克隆檢測陽性血清和陰性血清的。由于樣本含量較少，因此采用 Fisher 的精確檢驗(yàn)，，結(jié)果顯示克隆6、P13 的 p 均<0.01, 克隆 P25 的 p <0.05。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2553537