【摘要】：目的篩選噬菌體展示隨機(jī)12 肽庫(kù)中可以與HCV 抗體陽(yáng)性的血清特異性結(jié)合的序列,在HCV 表達(dá)的蛋白分子上找到這個(gè)抗原表位, 分析其序列、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與功能的關(guān)系。同時(shí)檢驗(yàn)用陰性血清逆向篩選是否能提高篩選效率。從而探討用噬菌體展示技術(shù)模擬HCV 抗原表位短肽,并用于對(duì)HCV 抗體檢測(cè)的應(yīng)用前景。 方法1. 用飽和硫酸銨鹽析法初提HCV 血清免疫球蛋白,再用DEAESehpadex A-50 進(jìn)一步純化。SDS-PAGE 鑒定純化蛋白的純度,ELISA 檢測(cè)純化蛋白的活性。2. 用純化免疫球蛋白對(duì)噬菌體展示隨機(jī)12 肽庫(kù)進(jìn)行3 輪親和篩選并同時(shí)進(jìn)行HCV 陰性血清逆向篩選。3. ELISA 方法檢測(cè)各輪篩選的富集效果以及第三輪篩選后隨機(jī)挑選的26 個(gè)噬菌體單克隆和HCV 陰性和陽(yáng)性血清反應(yīng)的特異性。4. Western blot 檢測(cè)各陽(yáng)性噬菌體單克隆展示多肽表位的類(lèi)型以及篩選后所得噬菌體多克隆所展示多肽的抗原類(lèi)型。5. 提取特異性噬菌體克隆單鏈DNA 并測(cè)定插入的外源序列。6. 利用生物信息學(xué)軟件呈現(xiàn)噬菌體展示多肽的三維結(jié)構(gòu);分析表位多肽的抗原相關(guān)性質(zhì)。 結(jié)果1) 經(jīng)過(guò)兩步純化后收集到免疫球蛋白的洗脫混合液,經(jīng)SDS-PAGE電泳后未見(jiàn)雜帶,達(dá)到電泳純。純化免疫球蛋白與HCV抗原ELISA反應(yīng)結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性。2) 在第二輪篩選中經(jīng)HCV陰性血清逆向篩選后的產(chǎn)出較對(duì)照明顯偏低。對(duì)照孔產(chǎn)出/投入為5.0×10-5,經(jīng)逆向吸收的篩選孔產(chǎn)出/投入為4.4×10-8。第三輪的產(chǎn)出/投入值較第二輪提高30多倍。3) ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在26個(gè)噬菌體單克隆中有5個(gè)克隆能與多份HCV陽(yáng)性血清結(jié)合而不與陰性血清反應(yīng),顯示較好的特異性(P0.05)。Western blot顯示第三輪篩選收集的多克隆噬菌體中存在HCV線性表位。4) 經(jīng)DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)5個(gè)克隆有2個(gè)克隆的DNA序列是完全相同的,即5個(gè)克隆包含了4種不同的抗原表位;同源性分析顯示YFQVGLESIPRP 與HCV蛋白分子1082～1093位的氨基酸同源性較高,而MNALRPLSPWPT與1954～1965位氨基酸同源性較高。5)與篩選表位序列YFQVGLESIPRP相同或相似的氨基酸在蛋白三維結(jié)構(gòu)上緊密相連,形成抗原應(yīng)有的構(gòu)象。兩個(gè)表位在HCV蛋白上的同源區(qū)表現(xiàn)出較好的抗原性質(zhì)。
【圖文】：

結(jié)果純化及鑒定后的免疫球蛋白經(jīng)過(guò) DEAE Sephadex A50 層析看到一個(gè)明顯的免疫球蛋白吸收峰（圖 1），收混合作為備用靶分子。分光光度計(jì)檢測(cè)濃度為 A-50 純化的 HCV 陽(yáng)性血清 IgG 達(dá)到電泳純(圖化的抗體為強(qiáng)陽(yáng)性。

LISA 結(jié)果輪篩選的產(chǎn)出物滴度測(cè)定平板（圖 4）上隨機(jī)挑取 26 個(gè)菌落分別 陽(yáng)性血清和 20 份陰性血清進(jìn)行 ELISA 實(shí)驗(yàn)鑒定各克隆的特異性。表示如下(圖 5、6、7、8，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表 2、3)�？寺� P2、P5、P6陽(yáng)性血清反應(yīng)的陽(yáng)性率依次為 6/8、6/8、4/8、5/8、3/8，且均不與反應(yīng)。用 SAS 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析各克隆檢測(cè)陽(yáng)性血清和陰性血清的。由于樣本含量較少，因此采用 Fisher 的精確檢驗(yàn)，，結(jié)果顯示克隆6、P13 的 p 均<0.01, 克隆 P25 的 p <0.05。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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