【摘要】：大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)經(jīng)過(guò)一系列翻譯后修飾，最后定位到自噬體膜上，目前已經(jīng)作為自噬體的分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于自噬過(guò)程和與之相關(guān)的許多生理，病理過(guò)程的研究中。我們以前報(bào)道了3個(gè)人LC3家族的新成員，LC3A，LC3B和LC3C。LC3A和LC3C與酵母Atg8和大鼠LC3相類似，經(jīng)歷了一系列的翻譯后修飾，包括羧基末端的切割；但LC3B羧基末端不被切割，產(chǎn)生了一種不同于大鼠LC3的依賴于羧基末端未被切割的賴氨酸(Lys122)的新的翻譯后修飾方式。最近日本學(xué)者報(bào)道人LC3B的羧基末端也能被切割，并進(jìn)一步在Gly120產(chǎn)生修飾，與大鼠LC3類似。 為了闡述清楚這個(gè)問(wèn)題，我們首先證明人LC3B由于可變剪接產(chǎn)生了兩種亞型，LC3B-α和LC3B-β，分別具有或缺失Arg70。LC3B-α和LC3B-β在人的多種組織中都廣泛表達(dá)。LC3B-α發(fā)生了典型的羧基末端切割反應(yīng)，而且定位到自噬體膜上；LC3B-β不能。當(dāng)LC3B-α的Gly120突變時(shí)，其羧基末端不能切割，此時(shí)LC3B-α的電泳行為與LC3B-β相同，且都受Lys122／121的影響。通過(guò)質(zhì)譜分析，我們發(fā)現(xiàn)盡管LC3B-β和LC3B-β-K121A在電泳上表現(xiàn)為相差2KD，但它們的分子量幾乎相同，也就是說(shuō)LC3B-β上沒(méi)有發(fā)生修飾。我們還對(duì)LC3B-α和LC3B-β的結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模擬，結(jié)果表明LC3B-α和LC3B-β的羧基末端具有不同的結(jié)構(gòu)：LC3B-α的羧基末端游離于其蛋白主體之外，不停的運(yùn)動(dòng)；而LC3B-β的羧基末端與其蛋白主體緊密結(jié)合在一起，是固定不動(dòng)的，，進(jìn)一步從結(jié)構(gòu)水平上解釋了為什么LC3B-α和LC3B-β的羧基末端具有不同的切割反應(yīng)。GST pull-down實(shí)驗(yàn)證明ATG4B與LC3B-α和LC3B-β都能相互作用，而且ATG4B能在體外切割LC3B-α的羧基末端。將LC3B-α和LC3B-β同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LC3B-β能抑制LC3B-α羧基末端的切割，并影響LC3B-α的修飾和自噬體膜定位，提示LC3B-β在體內(nèi)可能具有負(fù)調(diào)節(jié)自噬體形成的功能。 此外，本文還對(duì)本實(shí)驗(yàn)室以前克隆的大鼠LC3A和LC3B的翻譯后修飾方式進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。發(fā)現(xiàn)大鼠LC3A和LC3B經(jīng)過(guò)了與大鼠LC3相同的翻譯后羧基末端切割和修飾反應(yīng)，并且都能定位到自噬體膜上。而且羧基末端保守的甘氨酸 (Gly120)是大鼠LC3A和LC3B翻譯后羧基末端切割和修飾，以及自噬體膜定位所必須的。因此我們認(rèn)為大鼠LC3A和LC3B能作為新的自噬體分子標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于對(duì)自噬過(guò)程以及與之相關(guān)的生理和病理過(guò)程的研究之中。
【圖文】：

復(fù)旦大學(xué)博士論文第一章人LC3B一p的鑒定及其對(duì)LC3B一a的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制R68An一noncidsMl167Pr心·硯、tR秘AS’一AUG-一AUU一APos且t一onoth幾一月”a藝一el一rI685.993j一guaaU-一aaUag-卜一.Intron4一祠38885R69R7O人一AGG一CGC一V125一GUG一UA八3994.029R68Anlinoae鑫dsI，re·n一RNA5‘·AUG一“一AUU一AG·guaau-，二aauag·A一AG‘卜一一一Intron4‘一月R69V124一CGC一、·GUG。UAA一:PO，.11。一、合一hu.”“n‘hrl635.99338885，994032圖1.人LC3B基因第4個(gè)內(nèi)含子的3’末端發(fā)生可變剪接.(A)LC3B一a剪接形式具有3個(gè)連續(xù)的精氨酸殘基R68，R69，和R70.(B)LC3B一p剪接形式只有兩個(gè)連續(xù)的精氨酸殘基，相對(duì)應(yīng)于其氨基酸序列，編號(hào)為R68，R69，缺少R70.L哪Ba

圖3.藝乙朋、和乙之議了問(wèn)釣組織表達(dá)譜.(A)乙‘召刀艱不}以藝J刀節(jié)在18種人組織cDNA和2種人gtlo門1cONA(以“*”標(biāo)記)文庫(kù)中的表達(dá)情況.(B)乙￡萬(wàn)口渭在18種人組織種相對(duì)于乙乙扮公的表達(dá)卜度(LC3B一p/LC3B一a).接著我們以人肝gtlo/11eD、A文庫(kù)為模板擴(kuò)增LCB戍尺產(chǎn)物直接測(cè)序，結(jié)果證實(shí)產(chǎn)物是LC3B一a和LC3B一日的編碼區(qū)(O尺F)，將的混合物(圖4)。.﨑CAT仁C幾G，.寧人C.C^‘T七Te甲.C6G決CAG.臼GLc，B‘幾血GA下AA，T幾
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R341

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2547698