【摘要】： 目的構(gòu)建一個新的土撥鼠細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白-4(wCTLA-4)胞外部分和人乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)融合蛋白的表達質(zhì)粒pwCTLA-4-HBc,并檢測其編碼的融合蛋白在真核細胞中的表達和分泌情況,初步鑒定其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)相應(yīng)抗體生成的情況。為揭示其作用機制和進一步用于慢性患者免疫治療奠定基礎(chǔ)。 方法以德國埃森大學醫(yī)學院病毒所構(gòu)建的表達wCTLA-4與全長土撥鼠嗜肝病毒核心抗原(WHc)融合蛋白的質(zhì)粒pCTLA-4-C為模板,通過PCR獲得wCTLA-4胞外段和WHc前149位氨基酸融合蛋白編碼基因片段。pcDNA3.1/V5-His?TOPO?TA表達載體克隆獲得帶有V5-His標簽的表達質(zhì)粒pwCTLA-4-WHc。經(jīng)酶切鑒定和轉(zhuǎn)染幼倉鼠腎(BHK)細胞,間接免疫熒光方法檢測融合蛋白表達,證實其構(gòu)建成功。根據(jù)設(shè)計的酶切位點,將其與含人乙型肝炎病毒核心抗原全長基因片段(HBc)的質(zhì)粒pHcex同時雙酶切,然后T4連接酶連接,以HBc基因片段置換pwCTLA-4-WHc質(zhì)粒中的WHc片段。經(jīng)雙酶切鑒定插入片段大小方向正確,得到含土撥鼠CTLA-4蛋白胞外部分和HBc編碼序列的帶有V5-His標簽的表達質(zhì)粒pwCTLA-4-HBc。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細胞,間接免疫熒光方法(IF)檢測融合蛋白的表達。轉(zhuǎn)染人宮頸癌(Hela)細胞,細胞經(jīng)溫和裂解后收集上清與直接收集的細胞培養(yǎng)上清同時以化學發(fā)光微粒免疫法(CMIA)檢測融合蛋白的表達。純化質(zhì)粒肌肉注射BALB/cJ (H-2d)小鼠雙側(cè)后肢脛前肌,共免疫三次。最后一次免疫3周后,眼眶靜脈取血,分離血清,使用Enzygonost?抗-HBc/抗-HBe單克隆抗體試劑盒檢測篩查免疫小鼠抗-HBc/抗-HBe抗體陽性率。 結(jié)果融合蛋白重組質(zhì)粒pwCTLA-4-HBc經(jīng)雙酶切后均可獲得預(yù)期大小片段,重組體轉(zhuǎn)染的BHK細胞可檢測到HBc抗原特異性免疫熒光,pwCTLA-4-HBc轉(zhuǎn)染Hela細胞后細胞裂解液和培養(yǎng)上清中針對HBeAg的CMIA反應(yīng)呈強陽性,其中培養(yǎng)上清中抗原的相對濃度為細胞裂解液中的10倍。3次免疫結(jié)束后第二周末,wCTLA-4-HBc融合蛋白表達質(zhì)粒免疫組4只動物中,有2只產(chǎn)生了針對HBcAg特異性的抗體(抗-HBc陽性率50%),其中一只的血清也可檢測到抗-HBe(抗-HBe陽性率25%)。 結(jié)論成功構(gòu)建wCTLA-4胞外段和HBc融合蛋白表達質(zhì)粒pwCTLA-4-HBc;wCTLA-4-HBc融合蛋白可以在脂質(zhì)體介導(dǎo)下在真核細胞表達并可大量分泌到細胞外培養(yǎng)上清中;表達質(zhì)粒pwCTLA-4-HBc免疫小鼠可以誘導(dǎo)產(chǎn)生針對HBcAg/HBeAg的抗體應(yīng)答。
【圖文】：

ex 選用限制性內(nèi)切酶 EcoR V 和 Xho I 雙酶切后凝膠5．凝膠回收目的片段大小正確質(zhì)粒pwCTLA-4-WHc和pHc回收目的片段：含 wCTLA-4 的載體片段和 HBc，瓊脂糖凝膠電泳顯示為特性目的條帶，大小與預(yù)期相符。片段用于 T4 連接酶連接構(gòu)建 pwCTLA-4-HBc 達質(zhì)粒。wCTLA-4-WHc K5 200× wCTLA-4-WHc K6 200×c 融合蛋白在圖 5 wCTLA-4-WH BHK 細胞中表達M 1 2

華中科技大學同濟醫(yī)學院 6．雙酶切因 DNA 片段，長度為 549bps；Kpn I 和外段編碼 DNA 的片段，長度為 524bps，161 個氨基酸的編碼 DNA；Kpn I 和 Xho序列全長的 DNA 片段，，長度為 1073b wCTLA-4 胞外段和 HBc 融合蛋白表根據(jù)設(shè)計，EcoR V 和 Xho IpsM1 2 3
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R392;Q78

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳光明 ,楊富強;治療型HBV DNA疫苗的研究與應(yīng)用[J];解放軍醫(yī)學雜志;2003年06期

2 陳建忠,朱海紅,劉克洲,陳智;Enhancing cellular immune response to HBV M DNA vaccine in mice by codelivery of interleukin-18 recombinant[J];Journal of Zhejiang University Science;2004年04期

本文編號：2543046