【摘要】：目的 構(gòu)建SARS病毒E、M、N基因真核及原核表達(dá)重組質(zhì)粒,評價這3種基因在SARS病毒感染快速診斷以及疫苗研制中的價值。 方法 通過PCR擴(kuò)增獲得SARS-CoV E、M、N基因片斷,將其分別克隆入真核表達(dá)載體pVAX1,將所得真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVAX1-E、pVAX1-M和pVAX1-N分別肌肉注射小鼠和兔子,檢測動物體內(nèi)抗SARS-CoV抗體,觀察實驗期間動物的體重變化,處死后對重要臟器進(jìn)行病理檢查。將SARS-CoV E、M、N基因片斷克隆入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1,優(yōu)化表達(dá)條件、純化重組蛋白。以重組蛋白pGEX-4T-1%qN為抗原,檢測真核表達(dá)重組質(zhì)粒注射動物血清中抗體。 結(jié)果 真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVAX1-E、pVAX1-M和pVAX1-N以及原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/E、pGEX-4T-1/M和pGEX-4T-1/N基因測序結(jié)果與Gene bank公布的一致。真核表達(dá)重組質(zhì)粒經(jīng)肌肉注射免疫小鼠和兔子后,在動物體內(nèi)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗SARS-CoV抗體。通過觀察動物一般狀態(tài)和對重要臟器的病理研究顯示,重組質(zhì)粒安全無害。經(jīng)過IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳可見pGEX-4T-1/N BL21(DE3)有特異蛋白表達(dá)帶。誘導(dǎo)后的pGEX-4T-1/EBL21(DE3)和pGEX-4T-1/M BL21(DE3)菌體沉淀以鼠抗GST. tag為一抗,進(jìn)行Western blot,可發(fā)生免疫印劑反應(yīng)。通過western blot分析顯示重組蛋白pGEX-4T-1/N可與小鼠重組質(zhì)粒pVAX1-N免疫血清發(fā)生免疫印跡反應(yīng)。 結(jié)論 真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVAX1-E、pVAX1-M和pVAX1-N具有較好的免疫原性和安全性,有可能成為具有預(yù)防作用的基因疫苗。pGEX-4T-1/N BL21(DE3)可高效表達(dá)重組N蛋白,該蛋白有可能成為SARS-CoV感染血清學(xué)診斷的候選抗原之一。
【圖文】：

圖4:PCR方法分別釣取E、M基因DNAMarkerDLZOOO2、3:T一N上N基因的擴(kuò)增片斷;4、5:T一M上M基因的擴(kuò)增片斷;6、7:T一E上E基因的擴(kuò)增片斷圖5:PCR擴(kuò)增及Nhel、BamHI雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pvAXI一E1:PCR擴(kuò)增鑒定;2:Nhel/BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pVAXI一E3:Nhel/BamHI雙酶切載體pVAXI;4:DNAMarker

圖4:PCR方法分別釣取E、M基因DNAMarkerDLZOOO2、3:T一N上N基因的擴(kuò)增片斷;4、5:T一M上M基因的擴(kuò)增片斷;6、7:T一E上E基因的擴(kuò)增片斷圖5:PCR擴(kuò)增及Nhel、BamHI雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pvAXI一E1:PCR擴(kuò)增鑒定;2:Nhel/BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pVAXI一E3:Nhel/BamHI雙酶切載體pVAXI;4:DNAMarker
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R392.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李翠英;;最小生命體——病毒[J];農(nóng)藥市場信息;2011年20期

2 ;科技界聲音[J];科技導(dǎo)報;2011年17期

3 駱嘉偉;殷志強(qiáng);劉淑燕;;一種新的關(guān)聯(lián)特征和模糊聚類的進(jìn)化樹構(gòu)建方法[J];計算機(jī)應(yīng)用研究;2011年08期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關(guān)會議論文 前10條

1 馮金磊;王波;牛國君;郭宇;陳衛(wèi)強(qiáng);楊誠;饒子和;;具有SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制活性的秦艽有效成分研究[A];中國化學(xué)會第28屆學(xué)術(shù)年會第3分會場摘要集[C];2012年

2 何誠;朱虹;雷鳴;何君;檀華;左庭婷;楊琪;端青;;新分離人呼腸病毒和SARS-冠狀病毒感染小鼠病理學(xué)變化及發(fā)病機(jī)制[A];中國實驗動物學(xué)會第六屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2004年

3 朱關(guān)福;;嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)問題的探討[A];第6次全國微生物學(xué)與免疫學(xué)大會論文摘要匯編[C];2004年

4 甘燕;吳少庭;秦莉;潘暉榕;戴五星;袁仕善;黃達(dá)娜;;SARS冠狀病毒E蛋白DNA疫苗的構(gòu)建及其實驗免疫研究[A];全國寄生蟲學(xué)與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

5 李策生;張愛華;林連珍;李星;劉俊生;楊曉明;;有機(jī)溶劑/表面活性劑滅活血漿中的SARS冠狀病毒的研究[A];第6次全國微生物學(xué)與免疫學(xué)大會論文摘要匯編[C];2004年

6 楊松濤;夏咸柱;喬軍;高玉偉;閻芳;謝之景;趙忠鵬;黃耕;;SARS冠狀病毒N蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的表達(dá)與初步應(yīng)用[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

7 劉忠華;程樹軍;郭中敏;曲利芝;魏社林;顧為望;黃韌;;實驗動物和公園動物中SARS病原來源調(diào)查初報[A];中國實驗動物學(xué)會第六屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2004年

8 馬超楠;徐軍;;SARS冠狀病毒Spike蛋白預(yù)處理對LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響[A];中國病理生理學(xué)會第九屆全國代表大會及學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2010年

9 王紅霞;孟慶文;劉永剛;施建忠;孔憲剛;冉多良;吳東來;;SARS冠狀病毒未知蛋白5的原核表達(dá)[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第六次研討會論文集[C];2005年

10 潘暉榕;吳少庭;戴五星;雷明軍;袁仕善;秦莉;黃達(dá)娜;張仁利;高世同;;SARS冠狀病毒E蛋白的表達(dá)與純化[A];全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 艾啟平　王懷民;科研人員發(fā)現(xiàn)SARS冠狀病毒致命點[N];大眾科技報;2009年

2 記者 韓曉玲　通訊員 王懷民 楊雪;武大攻關(guān)SARS冠狀病毒研究[N];湖北日報;2009年

3 ;SARS：從未見過的冠狀病毒[N];中華工商時報;2003年

4 江南;抗SARS藥物找到了[N];人民日報;2005年

5 本報記者 徐陽;變種SARS仍然存在[N];江蘇科技報;2009年

6 姜廣策;SARS原兇“另有其人”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2003年

7 本報記者 倪永華;為攻克SARS而奮斗[N];科技日報;2003年

8 鄒聲文 周婷玉;非典病毒感染可能與ACE2有關(guān)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2005年

9 本報記者 譚勇;“中國干擾素之父”談SARS軟肋[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2003年

10 本報記者 韓璐 / 通訊員 黃顯斌 唐明山;發(fā)病當(dāng)日便可檢出冠狀病毒RNA[N];科技日報;2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王翠娥;SARS病原體鑒定、動物模型建立及滅活疫苗保護(hù)效果的病理學(xué)研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

2 魯小璐;SARS冠狀病毒N蛋白抑制beta干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2010年

3 周世力;腸道病毒71型基因組研究和SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的鑒定與分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

4 劉樹春;SARS冠狀病毒基因組及其編碼結(jié)構(gòu)蛋白的生物信息學(xué)研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2004年

5 楊寧;甲型H1N1流感病毒誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞凋亡機(jī)理研究及PI4KB調(diào)控SARS冠狀病毒細(xì)胞進(jìn)入機(jī)理研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年

6 王寶梅;SARS冠狀病毒S蛋白HLA-A～*0201限制性CD8～+T淋巴細(xì)胞表位的鑒定[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

7 趙琪;冠狀病毒復(fù)制酶系結(jié)構(gòu)與功能研究[D];清華大學(xué);2010年

8 劉利鋒;嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）康復(fù)者長期的體液免疫記憶反應(yīng)[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

9 張嘉杰;SARS冠狀病毒S蛋白抗原表位多肽的設(shè)計、合成及其免疫反應(yīng)[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

10 石嶸;SARS冠狀病毒檢測寡核苷酸基因芯片的研制及應(yīng)用[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 許寅超;SARS冠狀病毒N抗原蛋白表達(dá)及血清抗體檢測方法研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

2 張強(qiáng);SARS冠狀病毒核蛋白的原核表達(dá)及初步應(yīng)用的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2004年

3 胡日查;SARS冠狀病毒木瓜樣蛋白酶生物學(xué)功能研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 張玲;蝙蝠ACE2與SARS-CoV S蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸鑒別[D];黑龍江大學(xué);2010年

5 楊宇東;SARS冠狀病毒PLpro蛋白酶的生物學(xué)功能研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

6 謝燕丕;重慶地區(qū)兒童人類冠狀病毒流行情況[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

7 王曉佳;SARS冠狀病毒S糖蛋白基因的克隆表達(dá)[D];吉林大學(xué);2008年

8 欒翔凌;SARS病毒E、M、N基因克隆、表達(dá)及免疫原性初步研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

9 馬超楠;SARS冠狀病毒Spike蛋白預(yù)處理對細(xì)菌內(nèi)毒素介導(dǎo)的肺細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2010年

10 王超;SARS冠狀病毒免疫增強(qiáng)型核酸疫苗構(gòu)建及免疫效果評價[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

，

本文編號：2538602