發(fā)布時間：2019-09-18 14:04

【摘要】：本文采用大腸桿菌(E.coli-BL-21-DE3)為宿主細胞,pGEX4T-2質(zhì)粒為載體來表達人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(hBMP-2),分別研究了目的蛋白的表達、復(fù)性、純化及活性鑒定。本研究包括以下三個部分的工作: (1)表達 研究了單獨表達目的蛋白和融合有GST的情況下,在19℃、IPTG濃度為0.05和0.1mM的時,目的蛋白的表達情況;發(fā)現(xiàn)幾乎不存在目的蛋白的可溶性表達,目的蛋白大都以包含體形式存在。接著,我們優(yōu)化了IPTG的誘導(dǎo)濃度以提高目的蛋白表達量,結(jié)果示:當IPTG的濃度約為0.2～0.4時,目的蛋白表達量最大。 (2)稀釋和透析復(fù)性 分別采用分步稀釋和分步透析兩種方法,以尿素作為助溶劑,對目的蛋白進行復(fù)性,結(jié)果表明:稀釋復(fù)性法目的蛋白的收率不足5%,透析復(fù)性法收率不足1%。 (3)羥基磷灰石色譜復(fù)性基于天然BMP-2能夠與羥基磷灰石(HA)結(jié)合和色譜復(fù)性的理論基礎(chǔ),我們提出了利用HA色譜復(fù)性法來復(fù)性rhBMP-2的策略;通過優(yōu)選填料,摸索上樣、洗脫及氧化等條件,較為系統(tǒng)地研究了該復(fù)性方法的基本操作條件。實驗發(fā)現(xiàn)變性劑能夠降低HA吸附蛋白質(zhì)的載量,而不加用變性劑或用量很少又會導(dǎo)致變性蛋白在柱子中的沉淀;HA可以吸附常用氧化劑還原型和氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG),降低其氧化效果。據(jù)此,本文提出了色譜復(fù)性時,在進樣前后加用少量變性劑的策略,并優(yōu)化了上樣時變性劑的用量及變性蛋白的濃度,有效地改善了目的蛋白的吸附情況、提高了目的蛋白復(fù)性率;本文提出了柱后氧化的策略,并設(shè)計實驗,以溶菌酶為研究對象觀察了柱后氧化與柱中氧化的差異,證明了柱后氧化的優(yōu)越性。接著,研究了目的蛋白柱后氧化的條件,初步分析了pH值、溫度、蛋白濃度和GSSG、GSH的比例對目的蛋
【圖文】：

四川大學(xué)碩士學(xué)位論文親和填料作用的成分，，該條帶為融合蛋白的可能性不大。本圖采R一250染色。G對非融合目的蛋白表達量的影響電泳圖上看(圖7)，幾組細菌中目的蛋白表達的差異不十分明顯。系統(tǒng)軟件(Quant1ytOn)e分析后發(fā)現(xiàn):以0.2~0.4Mm時目的蛋最高，約占細菌總蛋白的17.%6。

圖337’C時目的蛋白表達電泳圖為分子量，arker，2為未誘導(dǎo)的工程茵，誘導(dǎo)后3.5小時的工程菌，4為粗制包含體圖4包含體蛋白的We:ter--nbl23和融，昌緝
【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R346

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 王婧;重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽原核表達及單克隆抗體制備[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

2 滕婷婷;人IgE受體蛋白FcεRIα-D2的原核表達及其對IgE的選擇吸附能力研究[D];大連理工大學(xué);2012年

本文編號：2537545