【摘要】：人體中的乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)及乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)在乙醇代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。若ADH及ALDH在人體內(nèi)均充分具備,則能較快得分解乙醇,減少究竟對中樞神經(jīng)的影響,因而即使攝入一定量的乙醇,其所含有的乙醇也能在很短時間內(nèi)得到充分的代謝。在人體中,ADH在一般情況下是可充分表達,且表達量基本持平的。人群內(nèi)缺乏ALDH的個體則較多,而ALDH的缺乏將導致乙醇不能被完全分解為水和二氧化碳,而是以乙醛的形式繼續(xù)留存于體內(nèi),使人在酒后產(chǎn)生惡心欲吐、昏迷不適等中樞神經(jīng)麻痹狀態(tài),即醉酒癥狀。其中的ALDH-2就是眾所周知的有高度遺傳多態(tài)性并與亞洲人群的飲酒行為密切相關(guān)的基因。近年來,隨著人們對獲得全新的、更有效的解酒保肝藥物的需求日益迫切,關(guān)于ALDH的研究工作更顯其深遠意義。 本文采用PCR技術(shù),克隆獲得了人aldh2基因,構(gòu)建質(zhì)粒pUCm-aldh2并對其測序,發(fā)現(xiàn)其與預期序列完全一致。再以質(zhì)粒pUCm-aldh2為模板進行PCR,并將這段含酶切位點的aldh2基因重組到原核表達載體pET22b(+)中,進行IPTG誘導表達,確認人ALDH-2蛋白已實現(xiàn)了高水平表達,最佳表達條件為37℃、1mmol/L IPTG濃度、誘導表達6h,表達量約占總蛋白的30%。二次洗滌包涵體,可以獲得純度較高的目的蛋白,這為工業(yè)化生產(chǎn)提供了條件。由于重組人ALDH-2融合了6×His標簽,使用Ni~(2+)親和層析純化,可以獲得超高純度的目的蛋白,親和層析結(jié)果表明,當咪唑濃度達到40mmol/L左右時,開始有目的蛋白洗出,直至咪唑濃度到達100mmol/L時結(jié)束。純化后的目的蛋白經(jīng)含有精氨酸的變性溶液稀釋復性后,進行活性檢測表明,該復性蛋白具有ALDH活性,比活力約為331.7U/mg。
【圖文】：

氨基酸序列缺乏保守性，僅有三個氨基酸殘基(Serl、Thrs及Prgo)是相同的。利用X射線衍射對這兩種同工酶的立體結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)這兩組氨基酸序列位于蛋白酶的表面，，但在四聚體構(gòu)象中，與其他亞基并沒有相互作用(見圖2)。.43蛋白表面非活性部位氨基酸的替換Hurely等人將人ALDH一1、ALDH一2的首21個氨基酸殘基分別與另一同功

浙、、學碩士學位論、勵PCR產(chǎn)物。于泳道1、2、3及4上的1sooPb左右可見清晰的明亮條帶(見圖5)，得知4個挑取的菌落均為陽性克隆。234M刁必0.刁當0.創(chuàng)的.0勺﨑盛，1睜.

本文編號：2535364