【摘要】：人體中的乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)及乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)在乙醇代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。若ADH及ALDH在人體內(nèi)均充分具備,則能較快得分解乙醇,減少究竟對(duì)中樞神經(jīng)的影響,因而即使攝入一定量的乙醇,其所含有的乙醇也能在很短時(shí)間內(nèi)得到充分的代謝。在人體中,ADH在一般情況下是可充分表達(dá),且表達(dá)量基本持平的。人群內(nèi)缺乏ALDH的個(gè)體則較多,而ALDH的缺乏將導(dǎo)致乙醇不能被完全分解為水和二氧化碳,而是以乙醛的形式繼續(xù)留存于體內(nèi),使人在酒后產(chǎn)生惡心欲吐、昏迷不適等中樞神經(jīng)麻痹狀態(tài),即醉酒癥狀。其中的ALDH-2就是眾所周知的有高度遺傳多態(tài)性并與亞洲人群的飲酒行為密切相關(guān)的基因。近年來(lái),隨著人們對(duì)獲得全新的、更有效的解酒保肝藥物的需求日益迫切,關(guān)于ALDH的研究工作更顯其深遠(yuǎn)意義。 本文采用PCR技術(shù),克隆獲得了人aldh2基因,構(gòu)建質(zhì)粒pUCm-aldh2并對(duì)其測(cè)序,發(fā)現(xiàn)其與預(yù)期序列完全一致。再以質(zhì)粒pUCm-aldh2為模板進(jìn)行PCR,并將這段含酶切位點(diǎn)的aldh2基因重組到原核表達(dá)載體pET22b(+)中,進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),確認(rèn)人ALDH-2蛋白已實(shí)現(xiàn)了高水平表達(dá),最佳表達(dá)條件為37℃、1mmol/L IPTG濃度、誘導(dǎo)表達(dá)6h,表達(dá)量約占總蛋白的30%。二次洗滌包涵體,可以獲得純度較高的目的蛋白,這為工業(yè)化生產(chǎn)提供了條件。由于重組人ALDH-2融合了6×His標(biāo)簽,使用Ni~(2+)親和層析純化,可以獲得超高純度的目的蛋白,親和層析結(jié)果表明,當(dāng)咪唑濃度達(dá)到40mmol/L左右時(shí),開(kāi)始有目的蛋白洗出,直至咪唑濃度到達(dá)100mmol/L時(shí)結(jié)束。純化后的目的蛋白經(jīng)含有精氨酸的變性溶液稀釋復(fù)性后,進(jìn)行活性檢測(cè)表明,該復(fù)性蛋白具有ALDH活性,比活力約為331.7U/mg。
【圖文】：

氨基酸序列缺乏保守性，僅有三個(gè)氨基酸殘基(Serl、Thrs及Prgo)是相同的。利用X射線衍射對(duì)這兩種同工酶的立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這兩組氨基酸序列位于蛋白酶的表面，，但在四聚體構(gòu)象中，與其他亞基并沒(méi)有相互作用(見(jiàn)圖2)。.43蛋白表面非活性部位氨基酸的替換Hurely等人將人ALDH一1、ALDH一2的首21個(gè)氨基酸殘基分別與另一同功

浙、、學(xué)碩士學(xué)位論、勵(lì)PCR產(chǎn)物。于泳道1、2、3及4上的1sooPb左右可見(jiàn)清晰的明亮條帶(見(jiàn)圖5)，得知4個(gè)挑取的菌落均為陽(yáng)性克隆。234M刁必0.刁當(dāng)0.創(chuàng)的.0勺﨑盛，1睜.

本文編號(hào)：2535364